شكرا لكم لزيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في هذه الأثناء، ولضمان الدعم المستمر، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
التوكسوبلازما جوندي هو طفيل أولي داخل الخلايا ينظم البيئة الدقيقة للمضيف المصاب ومن المعروف أنه يرتبط بحدوث نمو ورم في المخ.في هذه الدراسة، نفترض أن exosomal miRNA-21 الناتج عن عدوى التوكسوبلازما يعزز نمو ورم الدماغ.تم تشخيص الإكسوسومات من الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 المصابة بالتوكسوبلازما وتم تأكيد استيعاب خلايا الورم الدبقي U87.تم تحليل ملفات تعريف التعبير Exosomal microRNA باستخدام صفائف microRNA وmicroRNA-21A-5p المرتبطة بالتوكسوبلازما جوندي وفرز الورم.لقد بحثنا أيضًا في مستويات mRNA للجينات المرتبطة بالورم في خلايا الورم الدبقي U87 عن طريق تغيير مستويات miR-21 في الإكسوسومات وتأثير الإكسوسومات على تكاثر خلايا الورم الدبقي U87 البشري.في exosomes للخلايا الدبقية U87 المصابة بـ Toxoplasma gondii، يزداد التعبير عن microRNA-21 وينخفض ​​نشاط الجينات المضادة للأورام (FoxO1، PTEN، وPDCD4).الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالتوكسوبلازما تحفز تكاثر خلايا الورم الدبقي U87.تحفز الإكسوسومات نمو خلايا U87 في نموذج ورم الفأر.نقترح أن زيادة exosomal miR-21 في الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 المصابة بالتوكسوبلازما قد تلعب دورًا مهمًا كمحفز لنمو الخلايا في خلايا الورم الدبقي U87 عن طريق تقليل تنظيم الجينات المضادة للأورام.
تشير التقديرات إلى أنه تم تشخيص أكثر من 18.1 مليون حالة من حالات السرطان المتقدمة في جميع أنحاء العالم في عام 2018، مع تشخيص حوالي 297000 ورم في الجهاز العصبي المركزي كل عام (1.6% من جميع الأورام)1.وقد أظهرت الأبحاث السابقة أن عوامل الخطر للإصابة بأورام الدماغ البشرية تشمل المنتجات الكيميائية المختلفة، والتاريخ العائلي، والإشعاع المؤين من المعدات العلاجية والتشخيصية للرأس.ومع ذلك، فإن السبب الدقيق لهذه الأورام الخبيثة غير معروف.ما يقرب من 20% من جميع أنواع السرطان في جميع أنحاء العالم سببها عوامل معدية، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والطفيليات.تعمل مسببات الأمراض المعدية على تعطيل الآليات الوراثية للخلية المضيفة، مثل إصلاح الحمض النووي ودورة الخلية، ويمكن أن تؤدي إلى التهاب مزمن وتلف الجهاز المناعي 5 .
العوامل المعدية المرتبطة بسرطان الإنسان هي مسببات الأمراض الفيروسية الأكثر شيوعا، بما في ذلك فيروسات الورم الحليمي البشري وفيروسات التهاب الكبد B و C.يمكن أن تلعب الطفيليات أيضًا دورًا محتملاً في تطور السرطان لدى الإنسان.العديد من أنواع الطفيليات، وهي البلهارسيا، Opishorchis viverrini، O. felineus، Clonorchis sinensis وHymenolepis nana، متورطة في أنواع مختلفة من السرطان البشري 6،7،8.
التوكسوبلازما جوندي هو كائن أولي داخل الخلايا ينظم البيئة الدقيقة للخلايا المضيفة المصابة.وتشير التقديرات إلى أن هذا الطفيل يصيب حوالي 30% من سكان العالم، مما يعرض السكان بالكامل للخطر9،10.يمكن أن تصيب عدوى التوكسوبلازما الأعضاء الحيوية، بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وتتسبب في أمراض خطيرة مثل التهاب السحايا القاتل والتهاب الدماغ، وخاصة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة.ومع ذلك، يمكن أن يغير التوكسوبلازما جوندي أيضًا بيئة المضيف المصاب عن طريق تعديل نمو الخلايا والاستجابات المناعية لدى الأفراد ذوي الكفاءة المناعية، مما يؤدي إلى الحفاظ على عدوى مزمنة بدون أعراض.ومن المثير للاهتمام، بالنظر إلى العلاقة بين انتشار T. gondii وحدوث ورم في المخ، تشير بعض التقارير إلى أن التغيرات البيئية في الجسم الحي المضيف بسبب عدوى T. gondii المزمنة تشبه البيئة الدقيقة للورم.
تُعرف الإكسوسومات بأنها أجهزة اتصال بين الخلايا، حيث تقوم بتوصيل المحتوى البيولوجي، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية، من الخلايا المجاورة 16،17.يمكن أن تؤثر الإكسوسومات على العمليات البيولوجية المرتبطة بالورم مثل مقاومة موت الخلايا المبرمج، وتولد الأوعية، والانتشار في البيئة الدقيقة للورم.على وجه الخصوص، تعد miRNAs (miRNAs)، وهي RNAs صغيرة غير مشفرة يبلغ طولها حوالي 22 نيوكليوتيدات، من منظمات الجينات المهمة بعد النسخ والتي تتحكم في أكثر من 30٪ من mRNA البشري من خلال مجمع الإسكات الناجم عن miRNA (miRISC).يمكن لمرض التوكسوبلازما جوندي أن يعطل العمليات البيولوجية عن طريق التحكم في تعبير ميرنا في المضيفين المصابين.تحتوي miRNAs المضيفة على إشارات مهمة لتنظيم العمليات البيولوجية المضيفة لتحقيق استراتيجية بقاء الطفيل.وبالتالي، فإن دراسة التغييرات في ملف miRNA المضيف عند الإصابة بـ T. gondii يمكن أن تساعدنا على فهم التفاعل بين المضيف وT. gondii بشكل أكثر وضوحًا.في الواقع، ثيروغنانام وآخرون.اقترح 15 أن T. gondii يعزز تسرطن الدماغ عن طريق تغيير تعبيره على miRNAs المضيف المحدد المرتبط بنمو الورم ووجد أن T. gondii يمكن أن يسبب الأورام الدبقية في حيوانات التجارب.
تركز هذه الدراسة على تغيير exosomal miR-21 في الخلايا الدبقية الصغيرة المضيفة المصابة بـ Toxoplasma BV2.لاحظنا دورًا محتملًا لـ exosomal miR-21 المتغير في نمو خلايا الورم الدبقي U87 بسبب الاحتفاظ في نواة FoxO1 / p27، وهو هدف miR-21 المفرط التعبير عنه.
تم الحصول على Exosomes المشتقة من BV2 باستخدام الطرد المركزي التفاضلي والتحقق من صحتها بطرق مختلفة لمنع التلوث بالمكونات الخلوية أو الحويصلات الأخرى.أظهر التفريد الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد SDS (SDS-PAGE) أنماطًا متميزة بين البروتينات المستخرجة من خلايا BV2 والإكسوسومات (الشكل 1A)، وتم تقييم العينات لوجود Alix، والذي تم تحليله بواسطة النشاف الغربي لعلامات البروتين exosomal في .تم العثور على علامات Alix في بروتينات الإكسوسوم ولكن ليس في بروتينات المحللة الخلوية BV2 (الشكل 1 ب).وبالإضافة إلى ذلك، تم تحليل الحمض النووي الريبي المنقى من exosomes المستمدة من BV2 باستخدام محلل بيولوجي.ونادرا ما لوحظت وحدات فرعية الريبوسوم 18S و 28S في نمط هجرة الحمض النووي الريبي exosomal، مما يشير إلى نقاء موثوق به (الشكل 1C).أخيرًا، أظهر المجهر الإلكتروني النافذ أن حجم الإكسوسومات المرصودة يبلغ حوالي 60-150 نانومتر، ولها بنية تشبه الكوب نموذجية لمورفولوجيا الإكسوسوم (الشكل 1د).
توصيف exosomes المستمدة من خلايا BV2.(أ) صفحة ورقة بيانات السلامة.تم عزل البروتينات من خلايا BV2 أو الإكسوسومات المشتقة من BV2.تختلف أنماط البروتين بين الخلايا والإكسوسومات.(ب) تحليل لطخة غربية لعلامة exosomal (أليكس).(ج) تقييم الحمض النووي الريبي المنقى من خلايا BV2 والإكسوسومات المشتقة من BV2 باستخدام محلل حيوي.وهكذا، نادرًا ما يتم العثور على وحدات فرعية من الريبوسوم 18S و28S في خلايا BV2 في الحمض النووي الريبي الإكسوسومي.(د) أظهر المجهر الإلكتروني للإرسال أن الإكسوسومات المعزولة من خلايا BV2 كانت ملطخة سلبًا بـ 2% من خلات اليورانيل.يبلغ حجم الإكسوسومات حوالي 60-150 نانومتر وهي على شكل كوب (سونغ وجونغ، بيانات غير منشورة).
وقد لوحظ الاستيعاب الخلوي للexosomes المشتقة من BV2 في خلايا الورم الدبقي البشري U87 باستخدام المجهر متحد البؤر.يتم ترجمة الإكسوسومات المسمى PKH26 في السيتوبلازم لخلايا U87.كانت النوى ملطخة بـ DAPI (الشكل 2A)، مما يشير إلى أن الإكسوسومات المشتقة من BV2 يمكن استيعابها بواسطة الخلايا المضيفة والتأثير على بيئة الخلايا المتلقية.
أدى استيعاب exosomes المشتقة من BV2 إلى خلايا الورم الدبقي U87 والإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بـ Toxoplasma RH إلى تكاثر خلايا الورم الدبقي U87.(أ) Exosomes التي تجتاحها خلايا U87 تقاس بالمجهر متحد البؤر.تم تحضين خلايا الورم الدبقي U87 باستخدام exosomes تحمل علامة PKH26 (أحمر) أو بدون تحكم لمدة 24 ساعة.كانت النوى ملطخة بـ DAPI (الأزرق) ثم تمت ملاحظتها تحت مجهر متحد البؤر (شريط المقياس: 10 ميكرومتر، × 3000).(ب) تم تحديد تكاثر الخلايا الدبقية U87 عن طريق فحص تكاثر الخلايا.تم علاج خلايا الورم الدبقي U87 بالإكسوسومات في الوقت المحدد. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. *P < 0,05 متاح للطالب t-criteriю. * P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. * P <0.05 通过学生t 检验获得. * ف < 0.05 * P < 0,05, полученный с помощью t-criterия Стьюдента. * P <0.05 تم الحصول عليها باستخدام اختبار الطالب.
بعد التأكد من استيعاب الإكسوسومات المشتقة من BV2 في خلايا الورم الدبقي U87، أجرينا فحوصات تكاثر الخلايا للتحقيق في دور الإكسوسومات المشتقة من التوكسوبلازما BV2 في تطور خلايا الورم الدبقي البشري.أظهر علاج خلايا U87 مع exosomes من خلايا BV2 المصابة بـ T. gondii أن الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بـ T. gondii تسببت في تكاثر أعلى بكثير لخلايا U87 مقارنة بالتحكم (الشكل 2B).
بالإضافة إلى ذلك، كان لنمو خلايا U118 نفس نتائج U87، حيث تسببت الإكسوسومات المحفزة للتوكسوبلازما في أعلى مستويات التكاثر (البيانات غير معروضة).بناءً على هذه البيانات، يمكننا أن نشير إلى أن الإكسوسومات المصابة بالتوكسوبلازما المشتقة من BV2 تلعب دورًا مهمًا في تكاثر الخلايا الدبقية.
للتحقيق في تأثير الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالتوكسوبلازما على تطور الورم، قمنا بحقن خلايا الورم الدبقي U87 في فئران عارية لنموذج طعم أجنبي وحقننا الإكسوسومات المشتقة من BV2 أو الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالـ RH.بعد أن أصبحت الأورام واضحة بعد أسبوع واحد، تم تقسيم كل مجموعة تجريبية مكونة من 5 فئران وفقًا لحجم الورم لتحديد نفس نقطة البداية، وتم قياس حجم الورم لمدة 22 يومًا.
في الفئران باستخدام نموذج طعم أجنبي U87، لوحظ وجود حجم ووزن أكبر للورم في مجموعة الإكسوسوم المصابة بالـ RH المشتقة من BV2 في اليوم 22 (الشكل 3A، B).من ناحية أخرى، لم يكن هناك اختلاف كبير في حجم الورم بين مجموعة الإكسوسوم المشتقة من BV2 ومجموعة التحكم بعد علاج الإكسوسوم.بالإضافة إلى ذلك، أظهرت الفئران المحقونة بالخلايا الدبقية والأكسوزومات بصريًا أكبر حجم للورم في مجموعة الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالـ RH (الشكل 3C).توضح هذه النتائج أن الإكسوسومات المصابة بالتوكسوبلازما المشتقة من BV2 تحفز نمو الورم الدبقي في نموذج ورم الفأر.
تكوين الأورام (AC) للإكسوسومات المشتقة من BV2 في نموذج فأر طعم أجنبي U87.تم زيادة حجم الورم (A) والوزن (B) بشكل ملحوظ في الفئران العارية BALB/c التي عولجت بالإكسوسومات المصابة بالـ RH والمشتقة من BV2.تم حقن الفئران العارية BALB/c (C) تحت الجلد مع 1 × 107 خلايا U87 معلقة في خليط Matrigel.وبعد ستة أيام من الحقن، تمت معالجة 100 ميكروغرام من الإكسوسومات المشتقة من BV2 في الفئران.تم قياس حجم الورم ووزنه في الأيام المشار إليها وبعد التضحية، على التوالي. * ف < 0.05. * ف < 0.05. *Р <0,05. * ف < 0.05. * ف <0.05. * ف <0.05. *Р <0,05. * ف < 0.05.
أظهرت البيانات أن 37 miRNA (16 مفرط التعبير و 21 منخفض التعبير) المرتبطة بالمناعة أو تطور الورم قد تغيرت بشكل كبير في الخلايا الدبقية الصغيرة بعد الإصابة بسلالة التوكسوبلازما RH (الشكل 4A).تم تأكيد مستويات التعبير النسبي لـ miR-21 بين miRNAs المتغيرة بواسطة RT-PCR في الوقت الحقيقي في exosomes المستمدة من BV2، exosomes تعامل مع خلايا BV2 وU87.أظهر التعبير عن miR-21 زيادة كبيرة في exosomes من خلايا BV2 المصابة بـ Toxoplasma gondii (سلالة RH) (الشكل 4B).زادت مستويات التعبير النسبي لـ miR-21 في خلايا BV2 وU87 بعد امتصاص الإكسوسومات المتغيرة (الشكل 4B).كانت المستويات النسبية للتعبير miR-21 في أنسجة المخ لدى مرضى الأورام والفئران المصابة بداء المقوسات الغوندية (سلالة ME49) أعلى مما كانت عليه في الضوابط، على التوالي (الشكل 4C).ترتبط هذه النتائج بالاختلافات بين مستويات التعبير عن microRNAs المتوقعة والمؤكدة في المختبر وفي الجسم الحي.
التغييرات في التعبير عن exosomal miP-21a-5p في الخلايا الدبقية الصغيرة المصابة بـ Toxoplasma gondii (RH).(أ) يوضح التغيرات الكبيرة في سيرنا المرتبطة بتطور المناعة أو الورم بعد عدوى T. gondii RH.(ب) تم اكتشاف مستويات التعبير النسبية miR-21 بواسطة RT-PCR في الوقت الحقيقي في الإكسوسومات المشتقة من BV2، والإكسوسومات المعالجة بـ BV2، وخلايا U87.( C ) تم العثور على مستويات التعبير miR-21 النسبية في أنسجة المخ لمرضى الأورام ( N = 3) والفئران المصابة بـ Toxoplasma gondii (سلالة ME49) ( N = 3). * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. *P < 0,05 تم الوصول إليه من خلال اختبار t-criteriя Стьюдента. * تم الحصول على P <0.05 باستخدام اختبار الطالب. * P <0.05 通过学生t 检验获得. * ف < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-criterия Стьюдента. * P <0.05 تم الحصول عليها باستخدام اختبار الطالب.
أدت الإكسوسومات من خلايا BV2 المصابة بالـ RH إلى نمو الأورام الدبقية في الجسم الحي وفي المختبر (الشكل 2، 3).للكشف عن الرنا المرسال ذي الصلة، قمنا بفحص مستويات الرنا المرسال للجينات المستهدفة المضادة للأورام، وصندوق الشوكة O1 (FoxO1)، وPTEN، وموت الخلايا المبرمج 4 (PDCD4) في خلايا U87 المصابة بالإكسوسومات المشتقة من BV2 أو RH BV2.أظهر تحليل المعلوماتية الحيوية أن العديد من الجينات المرتبطة بالورم، بما في ذلك جينات FoxO1 وPTEN وPDCD4، لها مواقع ربط miR-2121,22.تم تخفيض مستويات مرنا من الجينات المستهدفة المضادة للورم في الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالـ RH مقارنة بالإكسوسومات المشتقة من BV2 (الشكل 5A).أظهر FoxO1 انخفاض مستويات البروتين في الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالـ RH مقارنة بالإكسوسومات المشتقة من BV2 (الشكل 5 ب).بناءً على هذه النتائج، يمكننا أن نؤكد أن الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصاب بالـ RH تعمل على تقليل تنظيم الجينات المضادة للأورام، والحفاظ على دورها في نمو الورم.
تحفز الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالتوكسوبلازما RH على قمع الجينات المضادة للأورام في خلايا الورم الدبقي U87 بواسطة الإكسوسومات المشتقة من BV2 المصابة بالتوكسوبلازما RH.( A ) PCR في الوقت الحقيقي لتعبير FoxO1 و PTEN و PDCD4 في exosomes المستمدة من BV2 المصابة بـ T. gondii RH مقارنة مع exosomes PBS.تم استخدام β-actin مرنا كعنصر تحكم.(ب) تم تحديد تعبير FoxO1 بواسطة النشاف الغربي وتم تقييم بيانات قياس الكثافة إحصائيًا باستخدام برنامج ImageJ. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. *P < 0,05 تم الوصول إليه من خلال اختبار t-criteriя Стьюдента. * تم الحصول على P <0.05 باستخدام اختبار الطالب. * P <0.05 通过学生t 检验获得. * ف < 0.05 * P <0,05, полученный с помощью t-criterия Стьюдента. * P <0.05 تم الحصول عليها باستخدام اختبار الطالب.
لفهم تأثير miP-21 في الإكسوسومات على تنظيم الجينات المرتبطة بالورم، تم نقل خلايا U87 باستخدام مثبط miP-21 باستخدام Lipofectamine 2000 وتم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن.وتمت مقارنة مستويات التعبير FoxO1 وp27 في الخلايا المنقولة بمثبطات miR-21 مع الخلايا المعالجة بالإكسوسومات المشتقة من BV2 باستخدام qRT-PCR (الشكل 6A، B).ترنسفكأيشن من مثبط miR-21 إلى خلايا U87 قلل بشكل كبير من تعبير FoxO1 و p27 (الشكل 6).
قام miP-21 المشتق من exosomal BV2 المصاب بـ RH بتغيير تعبير FoxO1 / p27 في خلايا الورم الدبقي U87.تم نقل خلايا U87 باستخدام مثبط miP-21 باستخدام Lipofectamine 2000 وتم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن.وتمت مقارنة مستويات التعبير FoxO1 وp27 في الخلايا المنقولة بمثبطات miR-21 مع المستويات الموجودة في الخلايا المعالجة بالإكسوسومات المشتقة من BV2 باستخدام qRT-PCR (A، B).
للهروب من الاستجابة المناعية للمضيف، يتحول طفيل التوكسوبلازما إلى كيس نسيجي.فهي تتطفل على الأنسجة المختلفة، بما في ذلك الدماغ والقلب والعضلات الهيكلية، طوال حياة المضيف وتعدل الاستجابة المناعية للمضيف.بالإضافة إلى ذلك، يمكنهم تنظيم دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج للخلايا المضيفة، وتعزيز تكاثرها.يصيب التوكسوبلازما في الغالب الخلايا الجذعية المضيفة، والعدلات، ونسب الوحيدات/البلاعم، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ.يستحث التوكسوبلازما جوندي تمايز الخلايا البلعمية من النمط الظاهري M2، ويؤثر على التئام الجروح بعد الإصابة بمسببات الأمراض، ويرتبط أيضًا بفرط الأوعية الدموية والتليف الحبيبي.قد يكون هذا التسبب السلوكي لعدوى التوكسوبلازما مرتبطًا بالعلامات المرتبطة بتطور الورم.قد تشبه البيئة المعادية التي ينظمها التوكسوبلازما الجسم السرطاني المقابل.ولذلك، يمكن الافتراض أن عدوى التوكسوبلازما يجب أن تساهم في تطور أورام المخ.في الواقع، تم الإبلاغ عن معدلات عالية من عدوى التوكسوبلازما في مصل المرضى الذين يعانون من أورام المخ المختلفة.بالإضافة إلى ذلك، قد يكون التوكسوبلازما جوندي مؤثرًا آخر مسببًا للسرطان ويعمل بشكل تآزري لمساعدة المواد المسرطنة المعدية الأخرى على تطوير أورام المخ.وفي هذا الصدد، تجدر الإشارة إلى أن فيروس P. falciparum وفيروس Epstein-Barr يساهمان بشكل تآزري في تكوين سرطان الغدد الليمفاوية في بوركيت.
لقد تم التحقيق على نطاق واسع في دور الإكسوسومات كمنظمين في مجال أبحاث السرطان.ومع ذلك، فإن دور الإكسوسومات بين الطفيليات والعوائل المصابة لا يزال غير مفهوم جيدًا.حتى الآن، قامت جهات تنظيمية مختلفة، بما في ذلك البروتينات المفرزة، بشرح العمليات البيولوجية التي من خلالها تقاوم الطفيليات الأولية هجوم المضيف وتديم العدوى.في الآونة الأخيرة، كان هناك مفهوم متزايد مفاده أن الحويصلات الدقيقة المرتبطة بالأوالي وجزيئاتها من الرنا الميكروي تتفاعل مع الخلايا المضيفة لخلق بيئة مواتية لبقائها.ولذلك، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاكتشاف العلاقة بين miRNAs exosomal المتغيرة وانتشار الخلايا الدبقية.يرتبط تغيير MicroRNA (الجينات العنقودية miR-30c-1، وmiR-125b-2، وmiR-23b-27b-24-1، وmiR-17-92) بمروج STAT3 في البلاعم البشرية المصابة بالتوكسوبلازما، وينظم ويحفز مضادات الأكسدة. - موت الخلايا المبرمج استجابة لعدوى التوكسوبلازما جوندي 29 .تزيد عدوى التوكسوبلازما من التعبير عن miR-17-5p وmiR-106b-5p، والتي ترتبط بالعديد من أمراض فرط التكاثر 30.تشير هذه البيانات إلى أن miRNAs المضيفة التي تنظمها عدوى التوكسوبلازما هي جزيئات مهمة لبقاء الطفيلي والتسبب في السلوك البيولوجي للمضيف.
يمكن أن تؤثر miRNAs المتغيرة على أنواع مختلفة من السلوك أثناء بدء وتطور الخلايا الخبيثة، بما في ذلك الأورام الدبقية: الاكتفاء الذاتي من إشارات النمو، وعدم الحساسية للإشارات المثبطة للنمو، والتهرب من موت الخلايا المبرمج، وإمكانات التكاثر غير المحدودة، وتولد الأوعية، والغزو والانبثاث، والالتهاب.في الورم الدبقي، تم التعرف على miRNAs المتغيرة في العديد من دراسات تحديد ملامح التعبير.
في هذه الدراسة، أكدنا مستويات عالية من التعبير ميرنا-21 في الخلايا المضيفة المصابة بالتوكسوبلازما.تم التعرف على miR-21 كواحد من الرنا الميكروي الأكثر تعبيرًا بشكل متكرر في الأورام الصلبة، بما في ذلك الأورام الدبقية، 33 ويرتبط تعبيرها بدرجة الورم الدبقي.تشير الأدلة المتراكمة إلى أن miR-21 عبارة عن جينات مسرطنة جديدة تعمل كعامل مضاد لموت الخلايا المبرمج في نمو الورم الدبقي ويتم التعبير عنها بشكل مفرط في الأنسجة والبلازما في الأورام الخبيثة في الدماغ البشري.ومن المثير للاهتمام أن تعطيل نشاط miR-21 في خلايا وأنسجة الورم الدبقي يؤدي إلى تثبيط تكاثر الخلايا بسبب موت الخلايا المبرمج المعتمد على كاسباس.كشف تحليل المعلومات الحيوية للأهداف المتوقعة لـ miR-21 عن العديد من الجينات الكابتة للورم المرتبطة بمسارات موت الخلايا المبرمج، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج 4 (PDCD4)، والتروبوميوزين (TPM1)، وPTEN، وصندوق الشوكة O1 (FoxO1)، مع موقع الربط miR-2121..22.38.
يشارك FoxO1، باعتباره أحد عوامل النسخ (FoxO)، في تطوير أنواع مختلفة من السرطان البشري ويمكنه تنظيم التعبير عن الجينات الكابتة للورم مثل p21، وp27، وBim، وFasL40.يمكن لـ FoxO1 ربط وتنشيط مثبطات دورة الخلية مثل p27 لقمع نمو الخلايا.علاوة على ذلك، يعد FoxO1 مؤثرًا رئيسيًا في إشارات PI3K/Akt وينظم العديد من العمليات البيولوجية مثل تقدم دورة الخلية وتمايز الخلايا من خلال تنشيط نسخ p2742.
في الختام ، نعتقد أن exosomal miR-21 المشتق من الخلايا الدبقية الصغيرة المصابة بالتوكسوبلازما قد يلعب دورًا مهمًا كمنظم لنمو خلايا الورم الدبقي (الشكل 7).ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لإيجاد صلة مباشرة بين exosomal miR-21، وعدوى التوكسوبلازما المتغيرة، ونمو الورم الدبقي.ومن المتوقع أن توفر هذه النتائج نقطة انطلاق لدراسة العلاقة بين عدوى التوكسوبلازما وحدوث الورم الدبقي.
يُقترح في هذه الدراسة رسم تخطيطي لآلية تسرطن الورم الدبقي (الدماغ).يرسم المؤلف في PowerPoint 2019 (Microsoft، Redmond، WA).
كانت جميع البروتوكولات التجريبية في هذه الدراسة، بما في ذلك استخدام الحيوانات، متوافقة مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية القياسية للجنة رعاية الحيوان والمستخدمين بجامعة سيول الوطنية وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بكلية الطب بجامعة سيول الوطنية (رقم IRB SNU-). 150715).-2).تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقًا لتوصيات ARRIVE.
تم استزراع الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 وخلايا الورم الدبقي البشري U87 في وسط النسر المعدل في Dulbecco (DMEM؛ Welgene، سيول، كوريا) ومتوسط ​​معهد Roswell Park Memorial (RPMI؛ Welgene)، على التوالي، يحتوي كل منها على 10٪ من مصل الأبقار الجنيني، 4 مم لتر - الجلوتامين، 0.2 ملي بنسلين و 0.05 ملي ستربتومايسين.تم استزراع الخلايا في حاضنة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.تم استخدام خط خلايا دبقي آخر، U118، للمقارنة مع خلايا U87.
لعزل exosomes من سلالات RH وME49 المصابة بـ T. gondii، تم حصاد T. gondii tachyzoites (سلالة RH) من تجويف البطن لفئران BALB/c عمرها 6 أسابيع تم حقنها قبل 3-4 أيام.تم غسل Tachyzoites ثلاث مرات باستخدام PBS وتنقيته بواسطة الطرد المركزي بنسبة 40٪ Percoll (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) .للحصول على tachyzoites من سلالة ME49، تم حقن الفئران BALB / c داخل الصفاق مع 20 كيسة من الأنسجة وتم جمع تحول tachyzoite في الخراجات عن طريق غسل تجويف البطن في اليوم 6-8 بعد الإصابة (PI).الفئران المصابة ببرنامج تلفزيوني.تمت زراعة tachyzoites ME49 في خلايا مكملة بـ 100 ميكروغرام / مل من البنسلين (Gibco / BRL ، Grand Island ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (Gibco / BRL) و 5٪ من مصل الأبقار الجنيني (Lonza، Walkersville، MD) .، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد الزراعة في خلايا فيرو، تم تمرير ME49 tachyzoites مرتين من خلال إبرة قياس 25 ثم من خلال مرشح 5 ميكرومتر لإزالة الحطام والخلايا.بعد الغسيل، تم إعادة تعليق التاكيزويت في PBS44.تم الحفاظ على الخراجات الأنسجة من سلالة التوكسوبلازما جوندي ME49 عن طريق الحقن داخل الصفاق من الخراجات المعزولة من دماغ الفئران المصابة C57BL / 6 (مركز أورينت بيو للحيوانات، سيونجنام، كوريا).تم حصاد أدمغة الفئران المصابة بـ ME49 بعد 3 أشهر من PI ومفرومة تحت المجهر لعزل الخراجات.تم الاحتفاظ بالفئران المصابة تحت ظروف خاصة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في كلية الطب بجامعة سيول الوطنية.
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من exosomes المشتقة من BV2 وخلايا وأنسجة BV2 باستخدام miRNeasy Mini Kit (Qiagen، Hilden، Germany) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة، بما في ذلك وقت الحضانة لخطوة الشطف.تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي (RNA) على مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000.تم تقييم جودة المصفوفات الدقيقة للحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام المحلل الحيوي Agilent 2100 (Agilent Technologies، Amstelveen، هولندا).
تم تحضير DMEM مع 10٪ FBS فقير exosome بواسطة الطرد المركزي الفائق عند 100000 جم لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية وتم ترشيحه من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (Nalgene، Rochester، NY، USA).تم استزراع خلايا BV2، 5 × 105، في DMEM التي تحتوي على 10٪ FBS مستنفد exosome ومضادات حيوية 1٪ عند 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.بعد 24 ساعة من الحضانة، تمت إضافة tachyzoites من سلالة RH أو ME49 (MOI = 10) إلى الخلايا وتمت إزالة الطفيليات غير الغازية في غضون ساعة وإعادة تعبئتها بـ DMEM.تم عزل الإكسوسومات من خلايا BV2 عن طريق الطرد المركزي التفاضلي المعدل، وهي الطريقة الأكثر استخدامًا.Resuspend وبيليه exosome في 300 ميكرولتر PBS لتحليل الحمض النووي الريبي أو البروتين.تم تحديد تركيز exosomes المعزولة باستخدام مجموعة فحص البروتين BCA (بيرس، روكفورد، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية) ومقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000.
تم التخلص من الرواسب من خلايا BV2 أو exosomes المشتقة من BV2 في محلول استخلاص البروتين PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology، Seongnam، Korea) وتم تحميل البروتينات على مواد هلامية بولي أكريلاميد SDS ملونة باللون الأزرق اللامع بنسبة 10٪ من Coomassie.وبالإضافة إلى ذلك، تم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF لمدة ساعتين.تم التحقق من صحة البقع الغربية باستخدام الجسم المضاد Alix (Cell Signaling Technology، Beverly، MA، USA) كعلامة exosomal.تم استخدام IgG (H + L) المضاد للفأر المترافق مع HRP (مختبرات Bethyl ، مونتغمري ، تكساس ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومحلل الصور الانارة LAS-1000 plus (Fuji Photography Film ، طوكيو ، اليابان) كجسم مضاد ثانوي..تم إجراء المجهر الإلكتروني النافذ لدراسة حجم وشكل الإكسوسومات.تم تحضير الإكسوسومات المعزولة من خلايا BV2 (6.40 ميكروغرام/ميكروليتر) على شبكات مغلفة بالكربون وملطخة سلبًا باستخدام أسيتات اليورانيل بنسبة 2% لمدة دقيقة واحدة.تمت ملاحظة العينات المحضرة بجهد تسارع قدره 80 كيلو فولت باستخدام JEOL 1200-EX II (طوكيو، اليابان) المجهز بكاميرا ES1000W Erlangshen CCD (جاتان، بليزانتون، كاليفورنيا، الولايات المتحدة الأمريكية).
تم تلوين exosomes المشتقة من BV2 باستخدام PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich، St. Louis، MO، USA) لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة الغرفة.تم تحضين خلايا U87، 2 × 105، مع exosomes المسمى PKH26 (أحمر) أو لا exosomes كعنصر تحكم سلبي، عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪.تم تلوين نواة خلية U87 باستخدام DAPI (الأزرق)، وتم تثبيت خلايا U87 في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ثم تم تحليلها في نظام مجهر متحد البؤر Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems، مانهايم، ألمانيا).يمكن ملاحظتها.
تم تصنيع [كدنا] من سيرنا باستخدام توليف حبلا Mir-X siRNA الأول ومجموعة SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc.، Shiga، Japan).تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام نظام الكشف عن PCR في الوقت الحقيقي iQ5 (Bio-Rad، Hercules، CA، USA) باستخدام الاشعال والقوالب الممزوجة بـ SYBR Premix.تم تضخيم الحمض النووي لمدة 40 دورة من تمسخ الطبيعة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية والتليين عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية.تم تحليل البيانات من كل تفاعل PCR باستخدام وحدة تحليل البيانات الخاصة ببرنامج النظام البصري iQ™5 (Bio-Rad).تم حساب التغيرات النسبية في التعبير الجيني بين الجينات المستهدفة المحددة وβ-actin/siRNA (وU6) باستخدام طريقة المنحنى القياسي.وترد تسلسلات التمهيدي المستخدمة في الجدول 1.
تم زرع 3 × 104 خلايا ورم دبقي U87 في 96 طبقًا جيدًا وتم خلطها مع exosomes المصابة بالتوكسوبلازما المشتقة من BV2 (50 ميكروغرام / مل) أو exosomes غير النبضية المستمدة من BV2 (50 ميكروغرام / مل) كعناصر تحكم عند 12 و 18 و 36 ساعة. .تم تحديد معدل تكاثر الخلايا باستخدام مجموعة عد الخلايا 8 (دوجيندو، كوماموتو، اليابان) (الأشكال التكميلية S1-S3) 46.
تم شراء فئران عارية BALB / c عمرها 5 أسابيع من Orient Bio (Seongnam-si، كوريا الجنوبية) وتم الاحتفاظ بها بشكل فردي في أقفاص معقمة عند درجة حرارة الغرفة (22 ± 2 درجة مئوية) والرطوبة (45 ± 15 درجة مئوية).%) في درجة حرارة الغرفة (22±2 درجة مئوية) والرطوبة (45±15%).تم إجراء دورة ضوئية مدتها 12 ساعة ودورة مظلمة مدتها 12 ساعة تحت SPF (مركز الحيوان بكلية الطب بجامعة سيول الوطنية).تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات من 5 فئران وتم حقن جميع المجموعات تحت الجلد بـ 400 مل من PBS تحتوي على 1 × 107 خلايا دبقي U87 وعامل نمو مخفض BD Matrigel ™ (BD Science، Miami، FL، USA).بعد ستة أيام من حقن الورم، تم حقن 200 ملغ من الإكسوسومات المشتقة من خلايا BV2 (مع/بدون عدوى التوكسوبلازما) في موقع الورم.بعد اثنين وعشرين يومًا من الإصابة بالورم، تم قياس حجم الورم لدى الفئران في كل مجموعة باستخدام الفرجار ثلاث مرات في الأسبوع، وتم حساب حجم الورم بالصيغة: 0.5 × (العرض) × 2 × الطول.
تحليل تعبير MicroRNA باستخدام صفيف miRCURYTM LNA miRNA، الجيل السابع يحتوي على صفائف mmu وrno (EXIQON، Vedbaek، الدنمارك) يغطي 1119 فأرًا يتميز جيدًا من بين 3100 تحقيقات التقاط miRNA البشرية والماوس والفئران.خلال هذا الإجراء، تمت إزالة 250 إلى 1000 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي (RNA) من الفوسفات 5 عن طريق العلاج باستخدام الفوسفاتيز القلوي المعوي في ربلة الساق متبوعًا بوضع العلامات باستخدام صبغة الفلورسنت الخضراء Hy3.تم بعد ذلك تهجين العينات الموسومة عن طريق تحميل شرائح ميكروأري باستخدام مجموعة أدوات غرفة التهجين (Agilent Technologies، Santa Clara، CA، USA) ومجموعة شرائح التهجين (Agilent Technologies).تم إجراء التهجين لمدة 16 ساعة عند 56 درجة مئوية، ثم تم غسل المصفوفات الدقيقة وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة.تم بعد ذلك فحص شرائح ميكروأري المعالجة باستخدام نظام الماسح الضوئي ميكروأري Agilent G2565CA (Agilent Technologies).تم استيراد الصور الممسوحة ضوئيًا باستخدام إصدار برنامج Agilent Features Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies) وتم قياس كمية التألق لكل صورة باستخدام ملف GAL المقابل لبروتوكول Exiqon المعدل.يتم إيداع بيانات ميكروأري للدراسة الحالية في قاعدة بيانات GEO تحت رقم الانضمام GPL32397.
تم تحليل ملفات تعريف التعبير عن miRNAs exosomal الناضجة في الخلايا الدبقية الصغيرة من سلالات RH أو ME49 المصابة بالتوكسوبلازما باستخدام أدوات الشبكة المختلفة.تم تحديد miRNAs المرتبطة بتطور الورم باستخدام miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) وتم ترشيحها بكثافة إشارة طبيعية (log2) أكبر من 8.0.بين miRNAs، تم العثور على miRNAs المعبر عنها تفاضليًا بأكثر من 1.5 مرة تم تغييرها عن طريق تحليل مرشح miRNAs الذي تم تغييره بواسطة سلالات RH أو ME49 المصابة بـ T. gondii.
تم زرع الخلايا في ستة أطباق جيدة (3 × 10 خلايا / بئر) في opti-MEM (Gibco، Carlsbad، CA، USA) باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen، Carlsbad، CA، USA).تم زراعة الخلايا المنقولة لمدة 6 ساعات ثم تم تغيير الوسط إلى وسط كامل جديد.تم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من ترنسفكأيشن.
تم إجراء التحليل الإحصائي بشكل أساسي باستخدام اختبار الطالب باستخدام برنامج Excel (مايكروسوفت، واشنطن العاصمة، الولايات المتحدة الأمريكية).لتحليل الحيوانات التجريبية، تم إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه باستخدام برنامج Prism 3.0 (برنامج GraphPad، La Jolla، CA، USA). واعتبرت القيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية. واعتبرت القيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية. Значения P <0,05 считались statистически значимыми. واعتبرت القيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية. P <0.05 被认为具有统计学意义. ف <0.05 Значения P <0,05 считались statистически значимыми. واعتبرت القيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية.
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية بكلية الطب بجامعة سيول الوطنية (رقم IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
فورلي، J. وآخرون.تقديرات الإصابة بالسرطان والوفيات العالمية المقدرة في عام 2018: مصادر وطرق GLOBOCAN.تفسير.جيه روك 144، 1941-1953 (2019).
Rasheed، S.، Rehman، K. & Akash، MS نظرة ثاقبة على عوامل الخطر لأورام المخ وتدخلاتها العلاجية. Rasheed، S.، Rehman، K. & Akash، MS نظرة ثاقبة على عوامل الخطر لأورام المخ وتدخلاتها العلاجية.رشيد، س.، رحمن، ك. وعكاش، MS مراجعة لعوامل الخطر لأورام المخ والتدخلات العلاجية الرئيسية. رشيد، س.، رحمن، ك. وعكاش، MS. Rasheed، S.، Rehman، K. & Akash، MS فهم عميق لعوامل خطر الإصابة بورم الدماغ والتدخلات العلاجية.رشيد، س.، رحمن، ك. وعكاش، MS مراجعة لعوامل الخطر لأورام المخ والتدخلات العلاجية الرئيسية.علم الطب الحيوي.صيدلاني.143، 112119 (2021).
Kato، I.، Zhang، J. & Sun، J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطانات الجهاز التناسلي البشري والجهاز التناسلي الأنثوي: ملخص للأدلة الوبائية والمخبرية. Kato، I.، Zhang، J. & Sun، J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطانات الجهاز التناسلي البشري والجهاز التناسلي الأنثوي: ملخص للأدلة الوبائية والمخبرية.Kato I., Zhang J. and Sun J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطان الجهاز الهضمي البشري والجهاز التناسلي الأنثوي: ملخص للبيانات الوبائية والمخبرية. كاتو، آي.، تشانغ، جيه. وصن، جي.总结. Kato، I.، Zhang، J. & Sun، J. التفاعل البكتيري الفيروسي في هضم تجويف الفم البشري والجهاز التناسلي الأنثوي: ملخص لعلم الأمراض الشائعة والأدلة المختبرية.Kato I., Zhang J. and Sun J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطان الجهاز الهضمي البشري وسرطان الأعضاء التناسلية الأنثوية: ملخص للبيانات الوبائية والمخبرية.السرطان 14، 425 (2022).
Magon، KL & Parish، JL من العدوى إلى السرطان: كيف تغير فيروسات ورم الحمض النووي استقلاب الكربون والدهون المركزي للخلية المضيفة. Magon، KL & Parish، JL من العدوى إلى السرطان: كيف تغير فيروسات ورم الحمض النووي استقلاب الكربون والدهون المركزي للخلية المضيفة.Mahon، KL and Parish، JL عدوى النار بالسرطان: كيف تغير فيروسات الورم المستندة إلى الحمض النووي استقلاب الكربون والدهون المركزي للخلية المضيفة. ماجون، كوالالمبور & باريش، JL Magon، KL & Parish، JL من العدوى إلى السرطان: كيف تغير فيروسات ورم الحمض النووي استقلاب الكربون والدهون المركزي للخلية المضيفة.Mahon، KL and Parish، JL يطلق العدوى إلى السرطان: كيف تغير فيروسات أورام الحمض النووي عملية التمثيل الغذائي للكربون والدهون المركزي في الخلايا المضيفة.فتح علم الأحياء.11، 210004 (2021).
كوريا دا كوستا، JM وآخرون.هرمون الاستروجين الكاتيكول من البلهارسيا ومثقوبة الكبد والسرطان المرتبط بالديدان الطفيلية.أمام.حار في الداخل.5، 444 (2014).