شكرا لكم لزيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في هذه الأثناء، ولضمان الدعم المستمر، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
يجب أن تستهدف النواقل الجينية لعلاج التليف الكيسي الرئوي المسالك الهوائية الموصلة، حيث أن نقل الرئة المحيطي ليس له أي تأثير علاجي.ترتبط كفاءة النقل الفيروسي ارتباطًا مباشرًا بوقت إقامة الناقل.ومع ذلك، فإن سوائل التوصيل مثل حاملات الجينات تنتشر بشكل طبيعي في الحويصلات الهوائية أثناء الاستنشاق، ويتم إزالة الجزيئات العلاجية من أي شكل بسرعة عن طريق النقل المخاطي الهدبي.يعد تمديد فترة إقامة حاملات الجينات في الجهاز التنفسي أمرًا مهمًا ولكن من الصعب تحقيقه.يمكن للجزيئات المغناطيسية المترافقة مع الناقل والتي يمكن توجيهها إلى سطح الجهاز التنفسي تحسين الاستهداف الإقليمي.بسبب مشاكل في التصوير داخل الجسم الحي، فإن سلوك هذه الجزيئات المغناطيسية الصغيرة على سطح مجرى الهواء في وجود مجال مغناطيسي مطبق غير مفهوم جيدًا.كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام التصوير السنكروتروني لتصور حركة سلسلة من الجزيئات المغناطيسية في القصبة الهوائية للفئران المخدرة في الجسم الحي من أجل دراسة ديناميكيات وأنماط سلوك الجزيئات المفردة والسائبة في الجسم الحي.قمنا بعد ذلك أيضًا بتقييم ما إذا كان تسليم الجزيئات المغناطيسية البطيئة في وجود مجال مغناطيسي من شأنه أن يزيد من كفاءة النقل في القصبة الهوائية للفئران.يُظهر التصوير بالأشعة السينية السنكروترونية سلوك الجزيئات المغناطيسية في المجالات المغناطيسية الثابتة والمتحركة في المختبر وفي الجسم الحي.لا يمكن سحب الجسيمات بسهولة عبر سطح الممرات الهوائية الحية باستخدام المغناطيس، ولكن أثناء النقل، تتركز الرواسب في مجال الرؤية، حيث يكون المجال المغناطيسي أقوى.تمت زيادة كفاءة النقل أيضًا بمقدار ستة أضعاف عندما تم تسليم جزيئات مغناطيسية lentiviral في وجود مجال مغناطيسي.مجتمعة، تشير هذه النتائج إلى أن الجزيئات المغناطيسية الفيروسية والمجالات المغناطيسية قد تكون أساليب قيمة لتحسين استهداف ناقلات الجينات ومستويات النقل في الشعب الهوائية الموصلة في الجسم الحي.
يحدث التليف الكيسي (CF) بسبب اختلافات في جين واحد يسمى منظم توصيل الغشاء CF (CFTR).بروتين CFTR هو قناة أيونية موجودة في العديد من الخلايا الظهارية في جميع أنحاء الجسم، بما في ذلك الشعب الهوائية، وهو موقع رئيسي في التسبب في التليف الكيسي.تؤدي العيوب في CFTR إلى نقل غير طبيعي للمياه، وجفاف سطح مجرى الهواء، وانخفاض عمق طبقة سائل سطح مجرى الهواء (ASL).كما أنه يضعف قدرة نظام النقل المخاطي الهدبي (MCT) على تنظيف الشعب الهوائية من الجسيمات المستنشقة ومسببات الأمراض.هدفنا هو تطوير العلاج الجيني للفيروسات البطيئة (LV) لتقديم النسخة الصحيحة من جين CFTR وتحسين ASL وMCT وصحة الرئة، ومواصلة تطوير تقنيات جديدة يمكنها قياس هذه المعلمات في الجسم الحي.
تعد نواقل البطين الأيسر أحد المرشحين الرئيسيين للعلاج الجيني للتليف الكيسي، ويرجع ذلك أساسًا إلى قدرتها على دمج الجين العلاجي بشكل دائم في الخلايا القاعدية للمجرى الهوائي (الخلايا الجذعية للمجرى الهوائي).وهذا أمر مهم لأنها يمكن أن تستعيد الترطيب الطبيعي وإزالة المخاط عن طريق التمايز إلى خلايا سطح مجرى الهواء الوظيفية المصححة بالجينات والمرتبطة بالتليف الكيسي، مما يؤدي إلى فوائد مدى الحياة.يجب أن يتم توجيه نواقل الجهد المنخفض ضد المسالك الهوائية الموصلة، حيث أن هذا هو المكان الذي يبدأ فيه تورط الرئة في التليف الكيسي.قد يؤدي توصيل الناقل إلى عمق الرئة إلى تنبيغ الحويصلات الهوائية، لكن هذا ليس له أي تأثير علاجي في التليف الكيسي.ومع ذلك، فإن السوائل مثل حاملات الجينات تهاجر بشكل طبيعي إلى الحويصلات الهوائية عند استنشاقها بعد الولادة ويتم طرد الجزيئات العلاجية بسرعة إلى تجويف الفم بواسطة MCTs.ترتبط كفاءة نقل LV ارتباطًا مباشرًا بطول الفترة الزمنية التي يظل فيها الناقل قريبًا من الخلايا المستهدفة للسماح بالامتصاص الخلوي - "وقت الإقامة" 5 والذي يتم تقصيره بسهولة عن طريق تدفق الهواء الإقليمي النموذجي بالإضافة إلى الامتصاص المنسق لجزيئات المخاط وجزيئات MCT.بالنسبة للتليف الكيسي، تعد القدرة على إطالة وقت بقاء البطين الأيسر في الشعب الهوائية أمرًا مهمًا لتحقيق مستويات عالية من النقل في هذه المنطقة، ولكنها كانت صعبة حتى الآن.
للتغلب على هذه العقبة، نقترح أن الجسيمات المغناطيسية ذات الجهد المنخفض (MPs) يمكن أن تساعد بطريقتين متكاملتين.أولاً، يمكن توجيهها بواسطة مغناطيس إلى سطح مجرى الهواء لتحسين الاستهداف ومساعدة الجزيئات الحاملة للجينات على التواجد في المنطقة الصحيحة من مجرى الهواء؛و ASL) ينتقلان إلى طبقة الخلية 6. يتم استخدام MPs على نطاق واسع كمركبات توصيل الدواء المستهدفة عندما ترتبط بالأجسام المضادة أو أدوية العلاج الكيميائي أو الجزيئات الصغيرة الأخرى التي ترتبط بأغشية الخلايا أو ترتبط بمستقبلات سطح الخلية الخاصة بها وتتراكم في مواقع الورم في وجود الكهرباء الساكنة.المجالات المغناطيسية لعلاج السرطان 7. تهدف طرق "ارتفاع الحرارة" الأخرى إلى قتل الخلايا السرطانية عن طريق تسخين النواب عند تعرضها للمجالات المغناطيسية المتذبذبة.مبدأ ترنسفكأيشن المغناطيسي، حيث يتم استخدام المجال المغناطيسي كعامل ترنسفكأيشن لتعزيز نقل الحمض النووي إلى الخلايا، يستخدم عادة في المختبر باستخدام مجموعة من ناقلات الجينات غير الفيروسية والفيروسية لخطوط الخلايا التي يصعب نقلها ..تم إثبات كفاءة النقل المغناطيسي للبطين الأيسر مع توصيل LV MP في المختبر إلى خط خلايا من ظهارة الشعب الهوائية البشرية في وجود مجال مغناطيسي ثابت، مما يزيد من كفاءة النقل بمقدار 186 مرة مقارنة مع ناقل الجهد المنخفض وحده.كما تم تطبيق LV MT على نموذج في المختبر من التليف الكيسي، حيث زاد ترنسفكأيشن المغناطيسي تنبيغ LV في الثقافات واجهة الهواء السائل بعامل 20 في وجود البلغم التليف الكيسي.ومع ذلك، في الجسم الحي المغنطيسي تلقى اهتمامًا قليلًا نسبيًا ولم يتم تقييمه إلا في عدد قليل من الدراسات على الحيوانات11،12،13،14،15، خاصة في الرئتين.ومع ذلك، فإن إمكانيات ترنسفكأيشن المغناطيسي في علاج الرئة في التليف الكيسي واضحة.تان وآخرون.(2020) ذكر أن "دراسة التحقق من صحة التوصيل الرئوي الفعال للجسيمات النانوية المغناطيسية ستمهد الطريق لاستراتيجيات استنشاق CFTR المستقبلية لتحسين النتائج السريرية لدى المرضى الذين يعانون من التليف الكيسي"6.
من الصعب تصور ودراسة سلوك الجزيئات المغناطيسية الصغيرة على سطح الجهاز التنفسي في ظل وجود مجال مغناطيسي مطبق، وبالتالي فإن فهمها ضعيف.في دراسات أخرى، قمنا بتطوير طريقة تصوير الأشعة السينية على النقيض من الطور على أساس انتشار السنكروترون (PB-PCXI) للتصوير غير الجراحي وتقدير التغيرات الدقيقة في الجسم الحي في عمق ASL18 وسلوك MCT19،20 لقياس ترطيب سطح قناة الغاز بشكل مباشر. ويستخدم كمؤشر مبكر لفعالية العلاج.بالإضافة إلى ذلك، تستخدم طريقة تسجيل MCT الخاصة بنا جزيئات قطرها 10-35 ميكرومتر مكونة من الألومينا أو الزجاج ذو معامل الانكسار العالي كعلامات MCT مرئية باستخدام PB-PCXI21.كلتا الطريقتين مناسبة لتصوير مجموعة من أنواع الجسيمات، بما في ذلك النواب.
نظرًا للدقة المكانية والزمانية العالية، فإن فحوصات ASL وMCT المستندة إلى PB-PCXI مناسبة تمامًا لدراسة الديناميكيات والأنماط السلوكية للجسيمات المفردة والسائبة في الجسم الحي لمساعدتنا على فهم طرق توصيل الجينات MP وتحسينها.يعتمد النهج الذي نستخدمه هنا على دراساتنا باستخدام خط شعاع SPring-8 BL20B2، حيث تصورنا حركة السوائل بعد توصيل جرعة من ناقل وهمي إلى الممرات الهوائية الأنفية والرئوية للفئران للمساعدة في شرح أنماط التعبير الجيني غير المتجانسة التي تمت ملاحظتها في الجينات لدينا.دراسات على الحيوانات بجرعة حاملة قدرها 3.4.
كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام السنكروترون PB-PCXI لتصور الحركات الحية لسلسلة من النواب في القصبة الهوائية للفئران الحية.تم تصميم دراسات التصوير PB-PCXI هذه لاختبار سلسلة MP وقوة المجال المغناطيسي والموقع لتحديد تأثيرها على حركة MP.لقد افترضنا أن المجال المغناطيسي الخارجي سيساعد على بقاء MF المسلم أو الانتقال إلى المنطقة المستهدفة.أتاحت لنا هذه الدراسات أيضًا تحديد تكوينات المغناطيس التي تزيد من كمية الجزيئات المتبقية في القصبة الهوائية بعد الترسيب.في سلسلة ثانية من الدراسات، كنا نهدف إلى استخدام هذا التكوين الأمثل لإظهار نمط النقل الناتج عن توصيل LV-MPs في الجسم الحي إلى الممرات الهوائية للفئران، على افتراض أن تسليم LV-MPs في سياق استهداف مجرى الهواء سيؤدي إلى في زيادة كفاءة نقل LV..
تم إجراء جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات التي وافقت عليها جامعة أديلايد (M-2019-060 وM-2020-022) ولجنة أخلاقيات الحيوان SPring-8 السنكروترون.تم إجراء التجارب وفقًا لتوصيات ARRIVE.
تم التقاط جميع صور الأشعة السينية في خط شعاع BL20XU في السنكروترون SPring-8 في اليابان باستخدام إعداد مشابه لتلك الموصوفة سابقًا .باختصار، يقع الصندوق التجريبي على بعد 245 مترًا من حلقة تخزين السنكروترون.يتم استخدام مسافة من العينة إلى الكاشف تبلغ 0.6 متر لدراسات تصوير الجسيمات و0.3 متر لدراسات التصوير في الجسم الحي لإنشاء تأثيرات تباين الطور.تم استخدام شعاع أحادي اللون بطاقة 25 كيلو فولت.تم الحصول على الصور باستخدام محول الأشعة السينية عالي الدقة (SPring-8 BM3) إلى جانب كاشف sCMOS.يقوم محول الطاقة بتحويل الأشعة السينية إلى ضوء مرئي باستخدام وميض بسمك 10 ميكرومتر (Gd3Al2Ga3O12)، والذي يتم توجيهه بعد ذلك إلى مستشعر sCMOS باستخدام هدف مجهر ×10 (NA 0.3).كان كاشف sCMOS عبارة عن Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics، Japan) بحجم صفيف يبلغ 2048 × 2048 بكسل وحجم بكسل أولي يبلغ 6.5 × 6.5 ميكرومتر.يوفر هذا الإعداد حجم بكسل متساويًا فعالًا يبلغ 0.51 ميكرومتر ومجال رؤية يبلغ حوالي 1.1 مم × 1.1 مم.تم اختيار مدة التعرض البالغة 100 مللي ثانية لتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء للجزيئات المغناطيسية داخل وخارج الشعب الهوائية مع تقليل آثار الحركة الناتجة عن التنفس.بالنسبة للدراسات المجراة، تم وضع مصراع سريع للأشعة السينية في مسار الأشعة السينية للحد من جرعة الإشعاع عن طريق منع شعاع الأشعة السينية بين التعرضات.
لم يتم استخدام وسائط LV في أي دراسات تصوير SPring-8 PB-PCXI لأن غرفة التصوير BL20XU ليست معتمدة من المستوى 2 للسلامة البيولوجية.وبدلاً من ذلك، اخترنا مجموعة من العناصر النائبة المميزة جيدًا من اثنين من البائعين التجاريين الذين يغطون مجموعة من الأحجام والمواد وتركيزات الحديد والتطبيقات - أولاً لفهم كيفية تأثير المجالات المغناطيسية على حركة النواب في الشعيرات الدموية الزجاجية، ثم في الشعب الهوائية الحية.سطح.يتراوح حجم MP من 0.25 إلى 18 ميكرومتر وهو مصنوع من مواد مختلفة (انظر الجدول 1)، ولكن تكوين كل عينة، بما في ذلك حجم الجزيئات المغناطيسية في MP، غير معروف.استنادًا إلى دراساتنا الشاملة لـ MCT 19، 20، 21، 23، 24، نتوقع أنه يمكن رؤية MPs حتى 5 ميكرومتر على سطح مجرى الهواء الرغامي، على سبيل المثال، عن طريق طرح إطارات متتالية لرؤية رؤية محسنة لحركة MP.تعد دقة MP الواحدة البالغة 0.25 ميكرومتر أصغر من دقة جهاز التصوير، ولكن من المتوقع أن يكتشف PB-PCXI تباينها الحجمي وحركة السائل السطحي الذي تترسب عليه بعد ترسبها.
عينات لكل نائب في الجدول.تم تحضير الشكل 1 في 20 ميكرولتر من الشعيرات الدموية الزجاجية (Drummond Microcaps، PA، USA) بقطر داخلي يبلغ 0.63 مم.تتوفر الجسيمات الحبيبية في الماء، بينما تتوفر جزيئات CombiMag في السائل الخاص بالشركة المصنعة.يمتلئ نصف كل أنبوب بالسائل (حوالي 11 ميكرولتر) ويوضع على حامل العينة (انظر الشكل 1).تم وضع الشعيرات الدموية الزجاجية أفقيًا على المسرح في غرفة التصوير، على التوالي، ووضعها على حواف السائل.تم ربط مغناطيس من النيكل يبلغ قطره 19 مم (طوله 28 مم) مصنوعًا من الأتربة النادرة والنيوديميوم والحديد والبورون (NdFeB) (N35، رقم القط LM1652، Jaycar Electronics، أستراليا) ببقايا تبلغ 1.17 T جدول نقل منفصل لتحقيق تغيير موضعك عن بعد أثناء العرض.يبدأ التصوير بالأشعة السينية عندما يتم وضع المغناطيس على ارتفاع 30 مم تقريبًا فوق العينة ويتم التقاط الصور بمعدل 4 إطارات في الثانية.أثناء التصوير، تم تقريب المغناطيس من الأنبوب الشعري الزجاجي (على مسافة حوالي 1 مم) ثم تم تحريكه على طول الأنبوب لتقييم تأثير شدة المجال وموضعه.
إعداد تصوير في المختبر يحتوي على عينات MP في الشعيرات الدموية الزجاجية في مرحلة ترجمة العينة xy.يتم تحديد مسار شعاع الأشعة السينية بخط أحمر منقط.
بمجرد إنشاء الرؤية المختبرية للنواب، تم اختبار مجموعة فرعية منهم في الجسم الحي على إناث فئران ويستار ألبينو من النوع البري (عمرها حوالي 12 أسبوعًا، حوالي 200 جم).ميديتوميدين 0.24 ملغم/كغم (Domitor®، Zenoaq، اليابان)، ميدازولام 3.2 ملغم/كغم (Dormicum®، Astellas Pharma، اليابان) وبوتورفانول 4 ملغم/كغم (Vetorphale®، Meiji Seika).تم تخدير الفئران بخليط فارما (اليابان) عن طريق الحقن داخل الصفاق.بعد التخدير، تم إعدادهم للتصوير عن طريق إزالة الفراء حول القصبة الهوائية، وإدخال أنبوب القصبة الهوائية (ET؛ قنية في الوريد 16 Ga، Terumo BCT)، وتثبيتهم في وضع الاستلقاء على لوحة تصوير مصنوعة خصيصًا تحتوي على كيس حراري للحفاظ على درجة حرارة الجسم.22. تم بعد ذلك ربط لوحة التصوير بمرحلة العينة في صندوق التصوير بزاوية طفيفة لمحاذاة القصبة الهوائية أفقيًا على صورة الأشعة السينية كما هو موضح في الشكل 2 أ.
(أ) في إعداد تصوير الجسم الحي في وحدة التصوير SPring-8، تم تحديد مسار شعاع الأشعة السينية بخط منقط أحمر.( ب، ج ) تم إجراء توطين مغناطيس القصبة الهوائية عن بعد باستخدام كاميرتين IP مثبتتين بشكل متعامد.على الجانب الأيسر من الصورة على الشاشة، يمكنك رؤية الحلقة السلكية التي تمسك الرأس وقنية التوصيل المثبتة داخل أنبوب ET.
تم توصيل نظام مضخة حقنة يتم التحكم فيها عن بعد (UMP2، World Precision Instruments، Sarasota، FL) باستخدام حقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر بأنبوب PE10 (0.61 مم OD، 0.28 مم ID) باستخدام إبرة 30 Ga.ضع علامة على الأنبوب للتأكد من أن الطرف في الموضع الصحيح في القصبة الهوائية عند إدخال الأنبوب الرغامي.باستخدام مضخة دقيقة، تمت إزالة مكبس المحقنة وتم غمر طرف الأنبوب في عينة MP المراد تسليمها.تم بعد ذلك إدخال أنبوب التوصيل المحمل في الأنبوب الرغامي، ووضع الطرف في أقوى جزء من المجال المغناطيسي المطبق المتوقع.تم التحكم في الحصول على الصور باستخدام كاشف التنفس المتصل بصندوق التوقيت المعتمد على Arduino، وتم تسجيل جميع الإشارات (على سبيل المثال، درجة الحرارة، والتنفس، وفتح/إغلاق الغالق، والحصول على الصور) باستخدام Powerlab وLabChart (AD Instruments، سيدني، أستراليا) 22 عند التصوير عندما لم يكن الغلاف متاحًا، تم وضع كاميرتي IP (Panasonic BB-SC382) على مسافة 90 درجة تقريبًا لبعضهما البعض وتم استخدامهما للتحكم في موضع المغناطيس بالنسبة للقصبة الهوائية أثناء التصوير (الشكل 2 ب، ج).لتقليل آثار الحركة، تم الحصول على صورة واحدة لكل نفس خلال هضبة التدفق التنفسي الطرفية.
يتم توصيل المغناطيس بالمرحلة الثانية، والتي قد تكون موجودة عن بعد على السطح الخارجي لجسم التصوير.تم اختبار المواقف والتكوينات المختلفة للمغناطيس، بما في ذلك: وضعها بزاوية حوالي 30 درجة فوق القصبة الهوائية (تظهر التكوينات في الشكلين 2 أ و3 أ)؛مغناطيس واحد فوق الحيوان والآخر أدناه، مع وضع القطبين للجذب (الشكل 3ب).، مغناطيس واحد فوق الحيوان والآخر أدناه، مع تعيين القطبين للتنافر (الشكل 3ج)، ومغناطيس واحد أعلاه وعمودي على القصبة الهوائية (الشكل ثلاثي الأبعاد).بعد إعداد الحيوان والمغناطيس وتحميل MP تحت الاختبار في مضخة الحقنة، قم بتوصيل جرعة قدرها 50 ميكرولتر بمعدل 4 ميكرولتر / ثانية عند الحصول على الصور.يتم بعد ذلك تحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا على طول القصبة الهوائية أو عبرها مع الاستمرار في التقاط الصور.
تكوين المغناطيس للتصوير في الجسم الحي (أ) مغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية بزاوية 30 درجة تقريبًا، (ب) مغناطيسين مهيأين للتجاذب، (ج) مغناطيسين مهيأين للتنافر، (د) مغناطيس واحد أعلاه وعمودي على القصبة الهوائية. قصبة هوائية.نظر المراقب إلى الأسفل من الفم إلى الرئتين عبر القصبة الهوائية ومرت شعاع الأشعة السينية عبر الجانب الأيسر من الجرذ وخرج من الجانب الأيمن.يتم تحريك المغناطيس على طول مجرى الهواء أو إلى اليسار واليمين فوق القصبة الهوائية في اتجاه شعاع الأشعة السينية.
سعينا أيضًا إلى تحديد مدى رؤية وسلوك الجزيئات في الشعب الهوائية في غياب اختلاط التنفس ومعدل ضربات القلب.لذلك، في نهاية فترة التصوير، تم القتل الرحيم للحيوانات بسبب جرعة زائدة من البنتوباربيتال (Somnopentyl، Pitman-Moore، Washington Crossing، USA؛ ~ 65 mg /kg ip).تُركت بعض الحيوانات على منصة التصوير، وبعد توقف التنفس ونبض القلب، تم تكرار عملية التصوير، مع إضافة جرعة إضافية من MP إذا لم يكن MP مرئيًا على سطح مجرى الهواء.
تم تصحيح الصور الناتجة للحقل المسطح والمظلم ثم تم تجميعها في فيلم (20 إطارًا في الثانية؛ 15-25 × السرعة العادية اعتمادًا على معدل التنفس) باستخدام برنامج نصي مخصص مكتوب بلغة MATLAB (R2020a، The Mathworks).
تم إجراء جميع الدراسات حول توصيل ناقلات الجينات LV في مركز أبحاث حيوانات المختبر بجامعة أديلايد، وتهدف إلى استخدام نتائج تجربة SPring-8 لتقييم ما إذا كان توصيل ناقلات الجينات LV-MP في وجود مجال مغناطيسي يمكن أن يعزز نقل الجينات في الجسم الحي. .لتقييم تأثيرات MF والمجال المغناطيسي، تمت معالجة مجموعتين من الحيوانات: تم حقن مجموعة واحدة بـ LV MF مع وضع المغناطيس، وتم حقن المجموعة الأخرى مع مجموعة مراقبة بـ LV MF بدون مغناطيس.
تم إنشاء ناقلات الجينات LV باستخدام الطرق الموصوفة سابقا 25، 26.يعبر ناقل LacZ عن جين بيتا جالاكتوزيداز النووي الموضعي الذي يقوده المروج التأسيسي MPSV (LV-LacZ)، والذي ينتج منتج تفاعل أزرق في الخلايا المنقولة، مرئيًا على جبهات وأقسام أنسجة الرئة.تم إجراء المعايرة في مزارع الخلايا عن طريق حساب عدد الخلايا الإيجابية LacZ يدويًا باستخدام مقياس الهيموكيتومتر لحساب العيار بـ TU/ml.يتم حفظ الحاملات بالتبريد عند -80 درجة مئوية، ثم إذابتها قبل الاستخدام، وربطها بـ CombiMag عن طريق الخلط بنسبة 1:1 واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسليم.
فئران سبراغ داولي الطبيعية (ن = 3/مجموعة، ~ 2-3 مخدرة مع خليط من 0.4 ملغم/كغم من الميديتوميدين (دوميتور، إليوم، أستراليا) و60 ملغم/كغم من الكيتامين (إليوم، أستراليا) عند عمر شهر واحد) ) الحقن والقنية عن طريق الفم غير الجراحية مع قنية في الوريد 16 غا.للتأكد من أن أنسجة مجرى الهواء الرغامي تتلقى نقل الجهد المنخفض، تم تكييفها باستخدام بروتوكول الاضطراب الميكانيكي الموصوف مسبقًا والذي تم فيه فرك سطح مجرى الهواء الرغامي محوريًا بسلة سلكية (N-Circle، مستخرج حجر الننتول بدون طرف NTSE-022115) -UDH، كوك ميديكال، الولايات المتحدة الأمريكية) 30 ص 28.ثم، بعد حوالي 10 دقائق من الاضطراب في خزانة السلامة الأحيائية، تم إجراء إدارة القصبة الهوائية لـ LV-MP.
تم تكوين المجال المغناطيسي المستخدم في هذه التجربة بشكل مشابه لدراسة الأشعة السينية في الجسم الحي، مع نفس المغناطيس الموجود فوق القصبة الهوائية مع مشابك دعامات التقطير (الشكل 4).تم تسليم حجم 50 ميكرولتر (2 × 25 ميكرولتر قسامة) من LV-MP إلى القصبة الهوائية (ن = 3 حيوانات) باستخدام ماصة هلام ذات الرؤوس كما هو موضح سابقا.تلقت المجموعة الضابطة (ن = 3 حيوانات) نفس LV-MP دون استخدام المغناطيس.بعد الانتهاء من التسريب، تتم إزالة القنية من الأنبوب الرغامي ويتم نزع أنبوب الحيوان.يبقى المغناطيس في مكانه لمدة 10 دقائق قبل إزالته.تم إعطاء الفئران جرعات تحت الجلد باستخدام الميلوكسيكام (1 مل / كجم) (إليوم، أستراليا) تليها سحب التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق من 1 ملغم / كغم من هيدروكلوريد أتيبامازول (أنتيسيدان، زويتيس، أستراليا).تم إبقاء الفئران دافئة ومراقبتها حتى الشفاء التام من التخدير.
جهاز توصيل LV-MP في خزانة السلامة البيولوجية.يمكنك أن ترى أن غلاف Luer-lock ذو اللون الرمادي الفاتح لأنبوب ET يبرز من الفم، ويتم إدخال طرف الماصة الهلامية الموضح في الشكل من خلال أنبوب ET إلى العمق المطلوب في القصبة الهوائية.
بعد أسبوع واحد من إجراء إدارة LV-MP، تم التضحية بالحيوانات بطريقة إنسانية عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100% وتم تقييم تعبير LacZ باستخدام علاج X-gal القياسي الخاص بنا.تمت إزالة حلقات الغضروف الذيلية الثلاثة الأكثر لضمان عدم تضمين أي ضرر ميكانيكي أو احتباس السوائل بسبب وضع الأنبوب الرغامي في التحليل.تم قطع كل القصبة الهوائية بالطول للحصول على نصفين للتحليل ووضعها في كوب يحتوي على مطاط السيليكون (Sylgard، Dow Inc) باستخدام إبرة Minutien (أدوات العلوم الجميلة) لتصور السطح اللمعي.تم تأكيد توزيع وخصائص الخلايا المنقولة من خلال التصوير الأمامي باستخدام مجهر نيكون (SMZ1500) مع كاميرا DigiLite وبرنامج TCapture (Tucsen Photonics، الصين).تم الحصول على الصور بتكبير 20x (بما في ذلك الإعداد الأقصى للعرض الكامل للقصبة الهوائية)، مع عرض كامل طول القصبة الهوائية خطوة بخطوة، مما يوفر تداخلًا كافيًا بين كل صورة للسماح "بخياطة" الصور.تم بعد ذلك دمج الصور من كل القصبة الهوائية في صورة مركبة واحدة باستخدام Composite Image Editor الإصدار 2.0.3 (Microsoft Research) باستخدام خوارزمية الحركة المستوية. تم قياس مساحة تعبير LacZ داخل الصور المركبة للقصبة الهوائية من كل حيوان باستخدام برنامج MATLAB الآلي (R2020a، MathWorks) كما هو موضح سابقًا، باستخدام إعدادات 0.35 <Hue <0.58، والتشبع> 0.15، والقيمة <0.7. تم قياس مساحة تعبير LacZ داخل الصور المركبة للقصبة الهوائية من كل حيوان باستخدام برنامج MATLAB الآلي (R2020a، MathWorks) كما هو موضح سابقًا، باستخدام إعدادات 0.35 <Hue <0.58، والتشبع> 0.15، والقيمة <0.7. تم تصميم LacZ التعبيري في صور حقيقية من الحياة اليومية بالكامل باستخدام الأتمتة سيناريو جديد MATLAB (R2020a، MathWorks)، كما تم وصفه بنطاق 28، مع استخدام 0,35 <القيمة <0,58، والقيمة> 0,15 والبداية <0 ,7. تم قياس مساحة تعبير LacZ في صور القصبة الهوائية المركبة من كل حيوان باستخدام برنامج MATLAB الآلي (R2020a، MathWorks) كما هو موضح سابقًا باستخدام إعدادات 0.350.15 والقيمة<0.7.تم تطوير برنامج MATLAB (R2020a، MathWorks) للحصول على أحدث المعلومات من LacZ من خلال موقع الويب الخاص به.用، 0.35 < 色调 < 0.58، 饱和度> 0.15 和值< 0.7 的设置.تم تطويره بواسطة Matlab （(r2020a , Mathworks) تم تطويره من قبل شركة Matlab في الوقت نفسه، يجب أن يكون 0.35 < 色调 <0.58 、> 0.15 و 0.7 <0.7 . .................... خاصرة نماذج LacZ التعبيرية للتصوير الفوتوغرافي الثابت لكل من الحياة اليومية المُجهزة باستخدام التشغيل الآلي سيناريو MATLAB (R2020a، MathWorks)، كما هو مذكور، مع استخدام 0,35 <القيمة <0,58، والأصل> 0,15 والقيمة <0,7 . تم قياس مناطق تعبير LacZ على الصور المركبة للقصبة الهوائية لكل حيوان باستخدام برنامج MATLAB الآلي (R2020a، MathWorks) كما هو موضح سابقًا باستخدام إعدادات 0.35 <درجة اللون <0.58 والتشبع> 0.15 والقيمة <0.7.من خلال تتبع ملامح الأنسجة في GIMP v2.10.24، تم إنشاء قناع يدويًا لكل صورة مركبة لتحديد منطقة الأنسجة ومنع أي اكتشافات خاطئة خارج أنسجة القصبة الهوائية.تم جمع المناطق الملطخة من جميع الصور المركبة من كل حيوان لإعطاء إجمالي المساحة الملطخة لهذا الحيوان.ثم تم تقسيم المنطقة المطلية على المساحة الإجمالية للقناع للحصول على مساحة طبيعية.
كانت كل قصبة هوائية مضمنة في البارافين ومقطعة بسمك 5 ميكرون.تمت مقاومة المقاطع باللون الأحمر السريع المحايد لمدة 5 دقائق وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر Nikon Eclipse E400 وكاميرا DS-Fi3 وبرنامج التقاط عناصر NIS (الإصدار 5.20.00).
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في GraphPad Prism v9 (GraphPad Software، Inc.).تم تحديد الأهمية الإحصائية عند p ≥0.05.تم اختبار الحالة الطبيعية باستخدام اختبار Shapiro-Wilk وتم تقييم الاختلافات في تلطيخ LacZ باستخدام اختبار t غير المقترن.
تم فحص النواب الستة الموضحين في الجدول 1 بواسطة PCXI، وتم توضيح الرؤية في الجدول 2. ولم يكن اثنان من النواب البوليستيرين (MP1 وMP2؛ 18 ميكرومتر و0.25 ميكرومتر، على التوالي) مرئيين بواسطة PCXI، ولكن يمكن تحديد العينات المتبقية (تظهر الأمثلة في الشكل 5).MP3 وMP4 مرئية بشكل ضعيف (10-15% Fe3O4؛ 0.25 ميكرومتر و0.9 ميكرومتر، على التوالي).على الرغم من أن MP5 (98% Fe3O4؛ 0.25 ميكرومتر) يحتوي على بعض من أصغر الجسيمات التي تم اختبارها، إلا أنه كان الأكثر وضوحًا.من الصعب التمييز بين منتج CombiMag MP6.في جميع الحالات، تم تحسين قدرتنا على اكتشاف MFs بشكل كبير عن طريق تحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا بشكل موازٍ للأوعية الشعرية.مع تحرك المغناطيس بعيدًا عن الشعيرات الدموية، تم سحب الجزيئات للخارج في سلاسل طويلة، ولكن مع اقتراب المغناطيس وزيادة قوة المجال المغناطيسي، تم تقصير سلاسل الجسيمات مع هجرة الجزيئات نحو السطح العلوي للشعيرات الدموية (انظر الفيديو التكميلي S1) : MP4)، مما يزيد من كثافة الجسيمات على السطح.على العكس من ذلك، عندما تتم إزالة المغناطيس من الشعيرات الدموية، تنخفض شدة المجال ويعاد ترتيب MPs في سلاسل طويلة تمتد من السطح العلوي للشعيرات الدموية (انظر الفيديو التكميلي S2: MP4).بعد توقف المغناطيس عن الحركة، تستمر الجزيئات في الحركة لبعض الوقت بعد وصولها إلى وضع التوازن.عندما يتحرك MP باتجاه السطح العلوي للأوعية الشعرية وبعيدًا عنه، تميل الجزيئات المغناطيسية إلى سحب الحطام عبر السائل.
تختلف رؤية MP ضمن PCXI بشكل كبير بين العينات.(أ) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5 و (د) MP6.تم التقاط جميع الصور المعروضة هنا باستخدام مغناطيس موضوع على بعد حوالي 10 مم مباشرة فوق الشعيرات الدموية.الدوائر الكبيرة الظاهرة هي فقاعات هواء محاصرة في الشعيرات الدموية، تظهر بوضوح ملامح الحافة السوداء والبيضاء لصورة تباين الطور.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.لاحظ أن أقطار الدوائر المغناطيسية في جميع الأشكال ليست قابلة للقياس وهي أكبر بحوالي 100 مرة مما هو موضح.
عندما يتحرك المغناطيس يسارًا ويمينًا على طول الجزء العلوي من الشعيرات الدموية، تتغير زاوية سلسلة MP لتتماشى مع المغناطيس (انظر الشكل 6)، وبالتالي تحديد خطوط المجال المغناطيسي.بالنسبة لـ MP3-5، بعد أن يصل الوتر إلى زاوية العتبة، يتم سحب الجزيئات على طول السطح العلوي للأوعية الشعرية.يؤدي هذا غالبًا إلى تجمع النواب في مجموعات أكبر بالقرب من المكان الذي يكون فيه المجال المغناطيسي أقوى (انظر الفيديو التكميلي S3: MP5).ويتجلى هذا أيضًا بشكل خاص عند التصوير بالقرب من نهاية الشعيرات الدموية، مما يؤدي إلى تجميع MP وتركيزه في واجهة الهواء السائل.الجسيمات الموجودة في MP6، والتي كان من الصعب تمييزها عن تلك الموجودة في MP3-5، لم تسحب عندما تحرك المغناطيس على طول الشعيرات الدموية، ولكن سلاسل MP انفصلت، تاركة الجسيمات في العرض (انظر الفيديو التكميلي S4: MP6).في بعض الحالات، عندما يتم تقليل المجال المغناطيسي المطبق عن طريق تحريك المغناطيس لمسافة طويلة من موقع التصوير، تنحدر أي نواب متبقية ببطء إلى السطح السفلي للأنبوب بفعل الجاذبية، وتبقى في السلسلة (انظر الفيديو التكميلي S5: MP3) .
تتغير زاوية السلسلة MP عندما يتحرك المغناطيس إلى اليمين فوق الأنبوب الشعري.(أ) MP3، (ب) MP4، (ج) MP5 و (د) MP6.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.يرجى ملاحظة أن مقاطع الفيديو الإضافية مخصصة لأغراض إعلامية لأنها تكشف عن بنية الجسيمات المهمة والمعلومات الديناميكية التي لا يمكن تصورها في هذه الصور الثابتة.
لقد أظهرت اختباراتنا أن تحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا ببطء على طول القصبة الهوائية يسهل رؤية الـ MF في سياق الحركة المعقدة في الجسم الحي.لم يتم إجراء أي اختبارات على الجسم الحي لأن حبات البوليسترين (MP1 وMP2) لم تكن مرئية في الشعيرات الدموية.تم اختبار كل من MFs الأربعة المتبقية في الجسم الحي مع وضع المحور الطويل للمغناطيس فوق القصبة الهوائية بزاوية تبلغ حوالي 30 درجة إلى الوضع الرأسي (انظر الشكلين 2 ب و 3 أ)، حيث أدى ذلك إلى سلاسل MF أطول وكان أكثر فعالية من المغناطيس..تم إنهاء التكوين.لم يتم العثور على MP3 وMP4 وMP6 في القصبة الهوائية لأي حيوان حي.عند تصور الجهاز التنفسي للفئران بعد قتل الحيوانات بطريقة إنسانية، ظلت الجزيئات غير مرئية حتى عند إضافة حجم إضافي باستخدام مضخة حقنة.يحتوي MP5 على أعلى محتوى من أكسيد الحديد وكان الجسيم الوحيد المرئي، لذلك تم استخدامه لتقييم وتوصيف سلوك MP في الجسم الحي.
أدى وضع المغناطيس فوق القصبة الهوائية أثناء إدخال MF إلى تركيز العديد من MFs، ولكن ليس كلها، في مجال الرؤية.من الأفضل ملاحظة دخول الجسيمات إلى القصبة الهوائية في الحيوانات التي تم قتلها بطريقة رحيمة إنسانياً.الشكل 7 والفيديو التكميلي S6: يُظهر MP5 الالتقاط المغناطيسي السريع ومحاذاة الجزيئات على سطح القصبة الهوائية البطنية، مما يشير إلى أنه يمكن استهداف النواب بالمناطق المرغوبة من القصبة الهوائية.عند البحث بشكل أبعد على طول القصبة الهوائية بعد تسليم MF، تم العثور على بعض MFs أقرب إلى الجؤجؤ، مما يشير إلى عدم كفاية قوة المجال المغناطيسي لجمع جميع MFs والاحتفاظ بها، حيث تم تسليمها عبر المنطقة ذات أقصى قوة للمجال المغناطيسي أثناء إدارة السوائل.عملية.ومع ذلك، كانت تركيزات MP بعد الولادة أعلى حول منطقة الصورة، مما يشير إلى أن العديد من MPs ظلوا في مناطق مجرى الهواء حيث كانت قوة المجال المغناطيسي المطبقة أعلى.
صور (أ) قبل و (ب) بعد تسليم MP5 إلى القصبة الهوائية لفأر تم قتله حديثًا مع مغناطيس يوضع فوق منطقة التصوير مباشرةً.تقع المنطقة المصورة بين حلقتين غضروفيتين.هناك بعض السوائل في الشعب الهوائية قبل تسليم النائب.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.هذه الصور مأخوذة من الفيديو الموجود في S6: فيديو تكميلي MP5.
أدى تحريك المغناطيس على طول القصبة الهوائية في الجسم الحي إلى تغيير في زاوية سلسلة MP على سطح مجرى الهواء، على غرار تلك التي لوحظت في الشعيرات الدموية (انظر الشكل 8 والفيديو التكميلي S7: MP5).ومع ذلك، في دراستنا، لا يمكن سحب النوابض على سطح الجهاز التنفسي الحي، كما يمكن أن تفعل الشعيرات الدموية.في بعض الحالات، تطول سلسلة MP عندما يتحرك المغناطيس يمينًا ويسارًا.ومن المثير للاهتمام أننا وجدنا أيضًا أن سلسلة الجسيمات تغير عمق الطبقة السطحية للسائل عندما يتم تحريك المغناطيس طوليًا على طول القصبة الهوائية، وتتوسع عندما يتم تحريك المغناطيس مباشرة فوق الرأس وتدوير سلسلة الجسيمات إلى وضع رأسي (انظر الفيديو التكميلي S7).: MP5 عند الدقيقة 0:09، أسفل اليمين).تغير نمط الحركة المميز عندما تم تحريك المغناطيس بشكل جانبي عبر الجزء العلوي من القصبة الهوائية (أي إلى يسار أو يمين الحيوان، وليس على طول القصبة الهوائية).كانت الجسيمات لا تزال مرئية بوضوح أثناء حركتها، ولكن عندما تمت إزالة المغناطيس من القصبة الهوائية، أصبحت أطراف سلاسل الجسيمات مرئية (انظر الفيديو التكميلي S8: MP5، بدءًا من الساعة 0:08).وهذا يتفق مع السلوك الملحوظ للمجال المغناطيسي تحت تأثير المجال المغناطيسي المطبق في الشعيرات الدموية الزجاجية.
عينة من الصور تظهر MP5 في القصبة الهوائية لفأر حي مخدر.(أ) يُستخدم المغناطيس لالتقاط الصور أعلى القصبة الهوائية وعلى يسارها، ثم (ب) بعد تحريك المغناطيس إلى اليمين.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.هذه الصور مأخوذة من الفيديو الموجود في الفيديو التكميلي لجهاز S7: MP5.
عندما تم ضبط القطبين في اتجاه الشمال والجنوب أعلى وأسفل القصبة الهوائية (أي الجذب؛ الشكل 3 ب)، ظهرت أوتار MP أطول وكانت موجودة على الجدار الجانبي للقصبة الهوائية بدلاً من السطح الظهري للقصبة الهوائية. القصبة الهوائية (انظر الملحق).فيديو S9:MP5).ومع ذلك، لم يتم اكتشاف تركيزات عالية من الجسيمات في موقع واحد (أي السطح الظهري للقصبة الهوائية) بعد إعطاء السوائل باستخدام جهاز مغناطيسي مزدوج، والذي يحدث عادةً باستخدام جهاز مغناطيسي واحد.ثم، عندما تم تكوين مغناطيس واحد لصد الأقطاب المتقابلة (الشكل 3ج)، لم يزد عدد الجزيئات المرئية في مجال الرؤية بعد الولادة.يعد إعداد كلا التكوينين المغناطيسيين أمرًا صعبًا نظرًا لقوة المجال المغناطيسي العالية التي تجذب المغناطيس أو تدفعه على التوالي.تم بعد ذلك تغيير الإعداد إلى مغناطيس واحد موازٍ للممرات الهوائية ولكن يمر عبر المسالك الهوائية بزاوية 90 درجة بحيث عبرت خطوط القوة جدار القصبة الهوائية بشكل متعامد (الشكل ثلاثي الأبعاد)، وهو اتجاه يهدف إلى تحديد إمكانية تراكم الجسيمات على الجدار الجانبي.أن يلاحظ.ومع ذلك، في هذا التكوين، لم تكن هناك حركة تراكم MF يمكن تحديدها أو حركة مغناطيس.بناءً على كل هذه النتائج، تم اختيار تكوين بمغناطيس واحد واتجاه 30 درجة لإجراء دراسات على الجسم الحي لحاملات الجينات (الشكل 3 أ).
عندما تم تصوير الحيوان عدة مرات مباشرة بعد التضحية به بطريقة إنسانية، كان غياب حركة الأنسجة المتداخلة يعني أنه يمكن تمييز خطوط الجسيمات الدقيقة والأقصر في المجال الغضروفي الواضح، "يتمايل" وفقًا للحركة الانتقالية للمغناطيس.نرى بوضوح وجود وحركة جزيئات MP6.
كان عيار LV-LacZ 1.8 × 108 وحدة دولية/مل، وبعد خلط 1:1 مع CombiMag MP (MP6)، تم حقن الحيوانات بـ 50 ميكرولتر من جرعة القصبة الهوائية 9 × 107 وحدة دولية/مل من مركبة LV (أي 4.5 × 106 تي يو/ فأر).)).).في هذه الدراسات، بدلاً من تحريك المغناطيس أثناء المخاض، قمنا بتثبيت المغناطيس في موضع واحد لتحديد ما إذا كان من الممكن (أ) تحسين نقل الجهد المنخفض مقارنة بتوصيل الناقل في غياب المجال المغناطيسي، و (ب) ما إذا كان مجرى الهواء ممكنًا كن مركزا.يتم نقل الخلايا في المناطق المستهدفة المغناطيسية في الجهاز التنفسي العلوي.
لا يبدو أن وجود المغناطيس واستخدام CombiMag مع ناقلات الجهد المنخفض يؤثر سلبًا على صحة الحيوان، كما هو الحال مع بروتوكولنا القياسي لتوصيل ناقلات الجهد المنخفض.أظهرت الصور الأمامية لمنطقة القصبة الهوائية المعرضة لاضطراب ميكانيكي (الشكل التكميلي 1) أن المجموعة المعالجة LV-MP لديها مستويات أعلى بكثير من النقل في وجود مغناطيس (الشكل 9 أ).فقط كمية صغيرة من تلطيخ LacZ الأزرق كانت موجودة في المجموعة الضابطة (الشكل 9 ب).أظهر القياس الكمي للمناطق الطبيعية الملطخة بـ X-Gal أن إعطاء LV-MP في وجود مجال مغناطيسي أدى إلى تحسن بمقدار 6 أضعاف تقريبًا (الشكل 9 ج).
مثال على الصور المركبة التي تظهر انتقال القصبة الهوائية باستخدام LV-MP (أ) في وجود مجال مغناطيسي و(ب) في غياب المغناطيس.(ج) تحسن ذو دلالة إحصائية في المنطقة الطبيعية لنقل LacZ في القصبة الهوائية باستخدام المغناطيس (* ع = 0.029، اختبار t، n = 3 لكل مجموعة، يعني ± الخطأ المعياري للوسط).
أشارت المقاطع المحايدة ذات اللون الأحمر السريع (المثال الموضح في الشكل التكميلي 2) إلى أن الخلايا الملطخة LacZ كانت موجودة في نفس العينة وفي نفس الموقع كما ورد سابقًا.
يظل التحدي الرئيسي في العلاج الجيني للمجرى الهوائي هو التوطين الدقيق للجزيئات الحاملة في المناطق ذات الاهتمام وتحقيق مستوى عالٍ من كفاءة النقل في الرئة المتنقلة في وجود تدفق الهواء وإزالة المخاط النشط.بالنسبة لحاملي الجهد المنخفض المخصص لعلاج أمراض الجهاز التنفسي في التليف الكيسي، فإن زيادة وقت بقاء الجزيئات الحاملة في المسالك الهوائية الموصلة كان حتى الآن هدفًا بعيد المنال.وكما أشار كاستيلاني وآخرون، فإن استخدام المجالات المغناطيسية لتعزيز عملية النقل له مزايا مقارنة بطرق توصيل الجينات الأخرى مثل الكهربي لأنه يمكن أن يجمع بين البساطة والاقتصاد والتوصيل الموضعي وزيادة الكفاءة ووقت حضانة أقصر.وربما جرعة أقل من المركبات10.ومع ذلك، في الجسم الحي ترسب وسلوك الجسيمات المغناطيسية في الشعب الهوائية تحت تأثير القوى المغناطيسية الخارجية لم يتم وصفها أبدًا، وفي الواقع لم يتم إثبات قدرة هذه الطريقة على زيادة مستويات التعبير الجيني في الشعب الهوائية الحية السليمة في الجسم الحي.
أظهرت تجاربنا المختبرية على السنكروترون PCXI أن جميع الجسيمات التي اختبرناها، باستثناء البوليسترين MP، كانت مرئية في إعداد التصوير الذي استخدمناه.في وجود مجال مغناطيسي، تشكل المجالات المغناطيسية أوتارًا، يرتبط طولها بنوع الجزيئات وقوة المجال المغناطيسي (أي قرب المغناطيس وحركته).كما هو موضح في الشكل 10، تتشكل الأوتار التي نلاحظها عندما يصبح كل جسيم على حدة ممغنطًا ويحفز مجاله المغناطيسي المحلي.تتسبب هذه الحقول المنفصلة في تجمع جسيمات أخرى مماثلة والاتصال بحركات السلسلة الجماعية بسبب القوى المحلية من قوى الجذب والتنافر المحلية للجسيمات الأخرى.
رسم تخطيطي يوضح (أ، ب) سلاسل من الجسيمات التي تتشكل داخل الشعيرات الدموية المملوءة بالسوائل و (ج، د) القصبة الهوائية المملوءة بالهواء.لاحظ أن الشعيرات الدموية والقصبة الهوائية لا يتم رسمها على نطاق واسع.تحتوي اللوحة (أ) أيضًا على وصف للموجات المتوسطة التي تحتوي على جزيئات Fe3O4 مرتبة في سلاسل.
عندما تحرك المغناطيس فوق الأنبوب الشعري، وصلت زاوية سلسلة الجسيمات إلى العتبة الحرجة لـ MP3-5 التي تحتوي على Fe3O4، وبعد ذلك لم تعد سلسلة الجسيمات تبقى في موضعها الأصلي، ولكنها انتقلت على طول السطح إلى موضع جديد.مغناطيس.من المحتمل أن يحدث هذا التأثير لأن سطح الشعيرات الدموية الزجاجية أملس بدرجة كافية للسماح بحدوث هذه الحركة.ومن المثير للاهتمام أن MP6 (CombiMag) لم يتصرف بهذه الطريقة، ربما لأن الجزيئات كانت أصغر حجمًا، أو كان لها طلاء أو شحنة سطحية مختلفة، أو أن السائل الحامل الخاص أثر على قدرتها على الحركة.كما أن التباين في صورة جسيم CombiMag أضعف أيضًا، مما يشير إلى أن السائل والجزيئات قد يكون لهما نفس الكثافة، وبالتالي لا يمكنهما التحرك بسهولة تجاه بعضهما البعض.يمكن أيضًا أن تتعثر الجسيمات إذا تحرك المغناطيس بسرعة كبيرة، مما يشير إلى أن قوة المجال المغناطيسي لا يمكنها دائمًا التغلب على الاحتكاك بين الجزيئات في السائل، مما يشير إلى أن قوة المجال المغناطيسي والمسافة بين المغناطيس والمنطقة المستهدفة لا ينبغي أن تأتي كعامل أساسي. مفاجأة.مهم.تشير هذه النتائج أيضًا إلى أنه على الرغم من قدرة المغناطيس على التقاط العديد من الجسيمات الدقيقة المتدفقة عبر المنطقة المستهدفة، فمن غير المحتمل الاعتماد على المغناطيس لتحريك جزيئات CombiMag على طول سطح القصبة الهوائية.وهكذا، خلصنا إلى أن دراسات LV MF في الجسم الحي يجب أن تستخدم مجالات مغناطيسية ثابتة لاستهداف مناطق محددة من شجرة مجرى الهواء فعليًا.
بمجرد وصول الجسيمات إلى الجسم، يصعب التعرف عليها في سياق الأنسجة المتحركة المعقدة للجسم، ولكن تم تحسين قدرتها على الكشف عن طريق تحريك المغناطيس أفقيًا فوق القصبة الهوائية "لهز" أوتار MP.في حين أن التصوير في الوقت الحقيقي ممكن، فمن الأسهل تمييز حركة الجسيمات بعد قتل الحيوان بطريقة إنسانية.كانت تركيزات MP عادةً أعلى في هذا الموقع عندما تم وضع المغناطيس فوق منطقة التصوير، على الرغم من وجود بعض الجسيمات عادةً أسفل القصبة الهوائية.وخلافًا للدراسات المختبرية، لا يمكن سحب الجسيمات إلى أسفل القصبة الهوائية عن طريق حركة المغناطيس.تتوافق هذه النتيجة مع كيفية معالجة المخاط الذي يغطي سطح القصبة الهوائية عادةً للجزيئات المستنشقة، ويحبسها في المخاط ثم يزيلها لاحقًا من خلال آلية التطهير المخاطي الهدبي.
لقد افترضنا أن استخدام المغناطيس أعلى وأسفل القصبة الهوائية للجذب (الشكل 3 ب) يمكن أن يؤدي إلى مجال مغناطيسي أكثر اتساقًا، بدلاً من مجال مغناطيسي شديد التركيز عند نقطة واحدة، مما قد يؤدي إلى توزيع أكثر اتساقًا للجزيئات..ومع ذلك، فإن دراستنا الأولية لم تجد دليلا واضحا يدعم هذه الفرضية.وبالمثل، فإن تعيين زوج من المغناطيسات للتنافر (الشكل 3ج) لم يؤد إلى استقرار المزيد من الجسيمات في منطقة الصورة.توضح هاتان النتيجتان أن إعداد المغناطيس المزدوج لا يحسن بشكل كبير التحكم المحلي في توجيه MP، وأن القوى المغناطيسية القوية الناتجة يصعب ضبطها، مما يجعل هذا النهج أقل عملية.وبالمثل، فإن توجيه المغناطيس فوق القصبة الهوائية وعبرها (الشكل ثلاثي الأبعاد) لم يؤدي أيضًا إلى زيادة عدد الجزيئات المتبقية في منطقة التصوير.قد لا تكون بعض هذه التكوينات البديلة ناجحة لأنها تؤدي إلى انخفاض شدة المجال المغناطيسي في منطقة الترسيب.وبالتالي، يعتبر تكوين المغناطيس الفردي عند 30 درجة (الشكل 3 أ) هو الطريقة الأبسط والأكثر كفاءة في اختبار الجسم الحي.
أظهرت دراسة LV-MP أنه عندما تم دمج نواقل LV مع CombiMag وتم تسليمها بعد تعرضها للاضطراب الجسدي في وجود مجال مغناطيسي، زادت مستويات النقل بشكل ملحوظ في القصبة الهوائية مقارنة بالمجموعة الضابطة.استنادًا إلى دراسات التصوير السنكروتروني ونتائج LacZ، يبدو أن المجال المغناطيسي قادر على الحفاظ على البطين الأيسر في القصبة الهوائية وتقليل عدد الجزيئات الناقلة التي توغلت على الفور في عمق الرئة.يمكن أن تؤدي تحسينات الاستهداف هذه إلى زيادة الكفاءة مع تقليل التتر المسلم، والانتقال غير المستهدف، والآثار الجانبية الالتهابية والمناعية، وتكاليف نقل الجينات.الأهم من ذلك، وفقًا للشركة المصنعة، يمكن استخدام CombiMag مع طرق نقل الجينات الأخرى، بما في ذلك النواقل الفيروسية الأخرى (مثل AAV) والأحماض النووية.