الجيارديا الاثني عشر هو كائن طفيلي يسبب داء الجيارديات، وهو عدوى معوية شائعة خاصة عند الأطفال الصغار الذين يعانون من علامات سريرية للإسهال.لقد أبلغنا سابقًا أن خارج الخلية G. duodenalis يؤدي إلى تنشيط النيوكليوتيدات المرتبطة بمستقبلات القلة داخل الخلايا 3 (NLRP3) وينظم الاستجابات الالتهابية المضيفة من خلال إفراز الحويصلة خارج الخلية (EV).ومع ذلك، فإن الأنماط الجزيئية الدقيقة لـ EV (GEV) المرتبطة بمسببات الأمراض والمشتركة في هذه العملية ودور الجسيم الالتهابي NLRP3 في داء الجيارديات لا تزال بحاجة إلى توضيح.
تم إنشاء بلازميدات التعبير حقيقية النواة المؤتلفة pcDNA3.1(+)-alpha-2 وalpha-7.3 giardins في GEV، وتم نقلها إلى البلاعم البريتونية الأولية للماوس، وتم اكتشافها عن طريق قياس جزيء الالتهاب المستهدف caspase-1.تم فحص مستوى التعبير P20..تم تحديد G. duodenalis alpha-2 و alpha-7.3 giardines في الأصل عن طريق قياس NLRP3 inflammasome (NLRP3، pro-interleukin-1 beta [IL-1β]، pro-caspase-1 and caspase-1 p20)، وإفراز IL.مستويات 1β، ومستويات قلة بروتين موت الخلايا المبرمج (ASC)، وتوطين الفلورسنت المناعي لـ NLRP3 وASC.تم بعد ذلك تقييم دور الجسيم الالتهابي NLRP3 في التسبب في بكتيريا G. duodenalis باستخدام الفئران التي تم فيها حظر تنشيط NLRP3 (الفئران المحظورة NLRP3) وتم رصد التغيرات المرضية في وزن الجسم والحمل الطفيلي في الاثني عشر وأنسجة الاثني عشر.بالإضافة إلى ذلك، قمنا بدراسة ما إذا كان الهيردين ألفا 2 وألفا 7.3 يحفزان إفراز IL-1β في الجسم الحي عبر الجسيم الالتهابي NLRP3 وحددنا دور هذه الجزيئات في التسبب في بكتيريا G. duodenalis في الفئران.
يحفز الجياردين Alpha-2 وalpha-7.3 على تنشيط NLRP3 inflammasome في المختبر.أدى ذلك إلى تنشيط p20 caspase-1، وزيادة في مستويات التعبير عن بروتينات NLRP3، وpro-IL-1β، وpro-caspase-1، وزيادة كبيرة في إفراز IL-1β، وتشكيل بقع ASA في السيتوبلازم وتحريض احتكار القلة ASA.التهاب NLRP3 يؤدي فقدان القضيب إلى تفاقم إمراضية G. duodenalis في الفئران.أظهرت الفئران التي عولجت بالكيسات عن طريق التزقيم من الفئران المحظورة بـ NLRP3 عددًا متزايدًا من الجوائز وأضرارًا جسيمة في الزغابات الاثني عشرية، والتي تتميز بخبايا نخرية منكمشة ومتفرعة.أظهرت التجارب في الجسم الحي أن الجياردين ألفا-2 وألفا-7.3 يمكن أن يحفز إفراز IL-1β عبر الجسيم الالتهابي NLRP3، كما أن التحصين باستخدام الجياردين ألفا-2 وألفا-7.3 قلل من إمراضية بكتيريا العفج في الفئران.
مجتمعة، تشير نتائج هذه الدراسة إلى أن الجيارديا ألفا 2 وألفا 7.3 تسببان زيادة في تنظيم التهاب NLRP3 المضيف وتقليل عدوى G. duodenalis في الفئران، والتي تعد أهدافًا واعدة للوقاية من داء الجيارديات.
الجيارديا الاثني عشر هو طفيل خارج الخلية يعيش في الأمعاء الدقيقة ويسبب 280 مليون حالة من داء الجيارديات مع الإسهال سنويا، وخاصة بين الأطفال الصغار في البلدان النامية [1].يصاب الأشخاص بالعدوى عن طريق شرب الماء أو الطعام الملوث بكيسات المتفطرة الاثني عشرية، التي تدخل بعد ذلك إلى المعدة وتفرز في العصارة المعدية.تلتصق جوائز الجيارديا الاثني عشر بظهارة الاثني عشر، مما يسبب الغثيان والقيء والإسهال وآلام البطن وفقدان الوزن.الأشخاص الذين يعانون من نقص المناعة والتليف الكيسي معرضون للإصابة بالعدوى.يمكن أن تحدث العدوى أيضًا عن طريق ممارسة الجنس عن طريق الفم والشرج [2].تعتبر الأدوية مثل ميترونيدازول وتينيدازول ونيتازوكسانيد هي خيارات العلاج المفضلة لالتهابات الاثني عشر [3].ومع ذلك، فإن أدوية العلاج الكيميائي هذه تسبب آثارًا جانبية ضارة مثل الغثيان والتسرطن والسمية الجينية [4].ولذلك، هناك حاجة إلى تطوير استراتيجيات أكثر فعالية للوقاية من عدوى G. Duodenalis.
الجسيمات الالتهابية هي فئة من مجمعات البروتين الخلوي التي تشكل جزءًا من الاستجابة المناعية الفطرية، مما يساعد في الدفاع ضد غزو مسببات الأمراض والتوسط في الاستجابات الالتهابية [5].من بين هذه الجسيمات الالتهابية، تمت دراسة مستقبِل قليلات الارتباط المرتبط بالنيوكليوتيدات (NOD) 3 (NLRP3) على نطاق واسع، وقد تمت دراسة قليلات الالتهاب المرتبطة بالنيوكليوتيدات (NLRP3) على نطاق واسع لأنه يمكن اكتشافه بواسطة أنماط جزيئية مختلفة مرتبطة بمسببات الأمراض/الأضرار (PAMP/ DAMP) يتعرف على جهاز المناعة الفطري وينشطه.وينظم التوازن المعوي في العديد من الأمراض الالتهابية [6،7،8].وهو يتألف من مستقبل التعرف على الأنماط (PRR) NLRP3، ومهايئ بروتين موت الخلايا المبرمج (ASC)، ومستجيب procaspase-1 أو procaspase-11.يعمل الجسيم الالتهابي NLRP3 كمضيف ضد غزو مسببات الأمراض، كما لوحظ في Neospora caninum [9]، و Paracoccidioides brasiliensis [10]، ودراسات الليشمانيا.[11]، ولكن تم الإبلاغ أيضًا عن أن تنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3 يحد من الاستجابات المناعية الوقائية ويؤدي إلى تفاقم تطور المرض، على سبيل المثال، في الديدان [12].بناءً على النتائج السابقة التي توصلنا إليها، أبلغنا أن G. duodenalis خارج الخلية يؤدي إلى تنشيط داخل الخلايا لالتهاب NLRP3 وينظم الاستجابات الالتهابية للمضيف عن طريق إفراز الحويصلات خارج الخلية (EVs) [13].ومع ذلك، فإن دور الجسيم الالتهابي NLRP3 في عدوى G. duodenalis في الجسم الحي لا يزال يتعين تحديده.
تم وصف الجياردين في الأصل على أنها مكونات هيكلية للهيكل الخلوي لـ G. duodenalis وتلعب دورًا مهمًا في حركية التروفوزويت وارتباط الخلايا الظهارية في الأمعاء الدقيقة.للتكيف بشكل أفضل مع البيئة وزيادة قدرتها على الإمراض، طورت G. duodenalis trophozoites بنية هيكلية خلوية فريدة تتكون من 8 أسواط، وجسم وسطي واحد، وقرص بطني واحد [14].تستخدم جوائز الجيارديا الاثني عشر هيكلها الخلوي لاختراق الأمعاء الدقيقة العلوية، وخاصة الاثني عشر، والالتصاق بالخلايا المعوية.إنها تهاجر باستمرار وتلتصق بالخلايا الظهارية باستخدام استقلاب الخلية.ولذلك، هناك علاقة وثيقة بين الهيكل الخلوي والفوعة.الجياردينات الخاصة بالجيارديا الاثني عشر هي مكونات هيكل الهيكل الخلوي [15] وتنقسم إلى أربع فئات: الجياردين α-، β-، γ-، وδ.هناك 21 فردًا من عائلة α-giardin، وجميعهم لديهم قدرة تعتمد على الكالسيوم لربط الفسفوليبيدات [16].كما أنها تربط الهيكل الخلوي بغشاء الخلية.في الأفراد الذين يعانون من الإسهال الناجم عن G. duodenalis، يتم التعبير عن الجياردين ألفا بشكل كبير ويكون مناعيًا أثناء العدوى [17].اللقاحات غير المتجانسة القائمة على الجيارديا ألفا -1 محمية ضد داء الجيارديات في الفئران وهي مستضدات مرشحة محتملة لتطوير اللقاح [18].يعزز Alpha-8 giardin، المتمركز في غشاء البلازما والسوط، ولكن ليس في القرص البطني، معدل حركية ونمو الجوائز في G. duodenalis [19].يرتبط Alpha-14 giardin بهياكل الأنابيب الدقيقة الموجودة على السوط ويؤثر على قابلية بقاء G. duodenalis [20].يتواجد ألفا-11 جياردين بكثرة طوال دورة الحياة، ويتسبب الإفراط في التعبير عن ألفا-11 جياردين في إتلاف بكتيريا الاثني عشر نفسها [21].ومع ذلك، فمن غير الواضح ما إذا كان ألفا-2 جياردين وألفا-7.3 جياردين يقيان من عدوى بكتيريا الاثني عشر وآلياتها الأساسية.
في هذه الدراسة، تم نقل بلازميدات التعبير حقيقية النواة المؤتلفة pcDNA3.1(+)-alpha-2 جياردين وpcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جياردين إلى البلاعم البريتونية الأولية للماوس لتنشيط المضيف NLRP3.ثم تم فحص الأهداف الملتهبة.قمنا أيضًا بتقييم دور NLRP3 inflammasome في التسبب في G. duodenalis، وتحققنا مما إذا كان الجياردين alpha-2 و alpha-7،3 يحفزان تنشيط NLRP3 inflammasome في الجسم الحي، وقررنا أن هذين الدورين للجياردين في التسبب في المرض. G. الاثني عشر.كان هدفنا المشترك هو تطوير أهداف واعدة للوقاية من عدوى G. Duodenalis.
تم شراء فئران أنثى من النوع البري (WT) C57BL/6 تتراوح أعمارها بين 5 و8 أسابيع من مركز لياونينغ تشانغشنغ للحيوانات التجريبية (لياونينغ، الصين).حصلت الفئران على حرية الوصول إلى الماء، وتلقت طعامًا معقمًا وتم الاحتفاظ بها في دورة ضوء / ظلام مدتها 12/12 ساعة.قبل الإصابة، تلقت الفئران المضادات الحيوية حسب الرغبة في مياه الشرب المكملة بالأمبيسلين (1 مجم / مل)، والفانكومايسين (1 مجم / مل)، والنيومايسين (1.4 مجم / مل) (جميعها تم شراؤها من شنغهاي، الصين، كائنات صناعية) [ 22 ].].تم قتل الفئران التي فقدت القدرة على الأكل والشرب لمدة تزيد عن 24 ساعة وفقدت ≥ 20% من وزن الجسم بطريقة رحيمة عن طريق خلع عنق الرحم.
تم استكمال WB G. duodenalis trovozoites (مجموعة American Type Culture Collection، Manassas، الولايات المتحدة الأمريكية) بـ 12.5٪ من مصل الأبقار الجنيني (FBS؛ Every Green، Zhejiang، China) و 0.1٪ من الصفراء البقرية (Sigma-Aldrich، St. Missouri، USA) ).الولايات المتحدة الأمريكية) في ظل الظروف الهوائية الدقيقة.تم جمع الجوائز المتكدسة على الجليد وتم تمريرها بنسبة 1:4 لمزيد من التكاثر.
تم تحفيز كيسات الجيارديا الاثني عشر كما هو موضح سابقًا [23]، وتم حصاد الجوائز في الطور اللوغاريتمي ثم تم تخفيفها باستخدام وسط محفز للتغليف، درجة الحموضة 7.1 (TYI-S-33 المعدلة) إلى تركيز نهائي قدره 1 × 106 جوائز / مل.تركيز الصفراء 0.05% متوسط).تمت زراعة التروفوزويت تحت ظروف لاهوائية عند 37 درجة مئوية حتى مرحلة النمو اللوغاريتمي.قم بتغيير الوسط إلى وسط محفز للكيس (الرقم الهيدروجيني 7.8؛ وسط TYI-S-33 معدل بتركيز 1٪ من الصفراء) وثقافة G. duodenalis عند 37 درجة مئوية لمدة 48-96 ساعة، والتي تمت خلالها ملاحظة تكوين الخراجات تحت المجهر.بعد أن تم حث معظم الجوائز على تكوين الأكياس، تم حصاد خليط الاستنبات وإعادة تعليقه في الماء المعقم منزوع الأيونات لتحلل الجوائز المتبقية.تم حساب الخراجات وتخزينها عند 4 درجات مئوية لتحليلها لاحقا من خلال أنبوب المعدة في الفئران.
تم إثراء حويصلات الجيارديا خارج الخلية (GEVs) كما هو موضح سابقًا [13].تمت إعادة تعليق التروفوزويت في مرحلة النمو اللوغاريتمي في وسط TYI-S-33 معدّل باستخدام FBS مستنفد exosome (الصناعات البيولوجية، بيت هعيمك، إسرائيل) إلى تركيز نهائي قدره 1 × 10 طفيليات / مل واحتضانها لمدة 12 ساعة.تم عزلها من طاف الثقافة بواسطة الطرد المركزي عند 2000 جم لمدة 10 دقائق، و10000 جم لمدة 45 دقيقة، و100000 جم لمدة 60 دقيقة.تم إذابة الرواسب في محلول ملحي بالفوسفات (PBS)، وتم قياس كميتها باستخدام مجموعة مقايسة البروتين BCA (Thermo Fisher Scientific، Waltham، MA، USA) وتخزينها عند -80 درجة مئوية أو استخدامها مباشرة لإجراء مزيد من التحليلات.
تم تحضير البلاعم البريتوني الأولية للماوس كما هو موضح سابقًا [24].باختصار ، تم حقن الفئران (التي تتراوح أعمارهم بين 6-8 أسابيع) (داخل الصفاق [ip]) مع 2.5 مل من 2.98٪ من وسط ثيوجليكول السائل Difco (BD، Franklin Lakes، NJ، USA) وتم تغذيتها 3-4 أذواق.تم جمع تعليق البلاعم من تجويف البطن للفئران بعد القتل الرحيم وطردها 3 مرات عند 1000 جم لمدة 10 دقائق.تم الكشف عن الخلايا المحصودة عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام علامة CD11b حتى تصل نقاء الخلية إلى> 98٪، ثم تضاف إلى لوحات زراعة الخلايا ذات 6 بئر (4.5 × 106 خلية / بئر) وحضنت بنسبة 10٪ FBS (الصناعة الحيوية) عند 37 درجة مئوية.و5% ثاني أكسيد الكربون.
تم استخراج الحمض النووي الريبي (RNA) من 1 × 107 من الجوائز في 1 مل من كاشف TRIzol (Vazyme، Nanjing، الصين)، وتم استخراج الحمض النووي الجينومي من إجمالي G. duodenalis RNA باستخدام MonScript dsDNase (Monad، Wuhan، China) وتم تصنيع الحمض النووي التكميلي (cDNA) باستخدام MonScript RTIIII Super Mix (Monad) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة.
تم الحصول على معلومات تسلسل CDS لجين G. duodenalis المستهدف من NCBI GenBank.استخدم Primer 5.0 لتصميم بادئات استنساخ سلسة محددة لكل جين مستهدف.يتكون التمهيدي الأمامي (5′-3′) من ثلاثة أجزاء: تسلسل متداخل مع ناقل خطي pcDNA3.1(+) EcoRV (TGGTGGAATTCTGCAGAT) وكودون البدء ATG وGNN (إذا لم تكن القاعدة الأولى G).يتم ذلك لتحسين كفاءة التعبير.بالإضافة إلى ذلك، ما لا يقل عن 16 قاعدة مجمعة (محتوى GC 40-60%/Tm حوالي 55 درجة مئوية).يتكون التمهيدي العكسي (5′-3′) من جزأين، تسلسل متداخل مع ناقل خطي EcoRV pcDNA3.1(+) (GCCGCCACTGTGCTGGAT) وقاعدة مدمجة لا تقل عن 16 نقطة أساس.(باستثناء المحطتين الأخيرتين).القواعد) كودون مثل AA أو GA للسماح للبلازميدات المؤتلفة بالتعبير عن بروتيناتها الموسومة).يتم سرد التسلسلات التمهيدية في الجدول 1 وتم تصنيعها بواسطة شركة Kangmet Biotechnology Co.، Ltd. (Changchun، الصين).
تم تضخيم الأهداف باستخدام بوليميريز الحمض النووي Pfu (تيانجين ، بكين ، الصين) أو Ex-taq (Takara Biomedical Technology [Beijing] Co.، Ltd.، Beijing، China) باستخدام G. duodenalis cDNA المُعد كقالب.تم خطيًا ناقل التعبير البلازميد حقيقي النواة pcDNA3.1 (+) باستخدام إنزيم التقييد EcoRV وإزالته من الفسفرة باستخدام Fast AP (Thermo Fisher Scientific).تمت تنقية شظايا pcDNA3.1 (+) الخطية وشظايا الجينات المستهدفة المضخمة باستخدام مجموعة تنقية هلام الحمض النووي (Tiangen) وتم قياسها كميًا باستخدام Nanodrop ND-2000 (Thermo Fisher Scientific).تمت إعادة دمج جزء pcDNA3.1 (+) وكل جزء من الجينات المستهدفة باستخدام مزيج استنساخ التجميع الفردي MonClone (Monad Biotech Co.، Ltd.، Suzhou، China) وتم تأكيده من خلال تسلسل الحمض النووي باستخدام Comate Bioscience Company Limited (Changchun، الصين)..
تم إنشاء البلازميدات الخالية من السموم الداخلية pcDNA3.1(+)-alpha-2 وpcDNA3.1(+)-alpha-7.3 باستخدام مجموعة Plasmid Mini Kit الخالية من السموم الداخلية SanPrep (Sangon Biotech).تم الحفاظ على التركيز أعلى من 500 نانوغرام / ميكرولتر للتأكد من أن EDTA الموجود في محلول الشطف لم يتداخل مع اختبار ترنسفكأيشن.تمت زراعة البلاعم البريتونية الأولية للفأر في 6 أطباق جيدة مع وسط RPMI 1640 كامل (الصناعات البيولوجية) لمدة 12 ساعة، ثم تم غسل الخلايا 3 مرات في برنامج تلفزيوني دافئ لإزالة البنسلين والستربتومايسين، ثم في وسط مكمل بوسط كامل.تم تخفيف البلازميدات الخالية من السموم الداخلية pcDNA3.1 (+) -alpha-2 و pcDNA3.1 (+) -alpha-7.3 (2.5 ميكروغرام) في 125 ميكرولتر من وسط المصل المخفض Opti-MEM (Gibco، Thermo Fisher Scientific)..ثم تم تخفيف 5 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن Lipofectamine 2000 (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific) في 125 ميكرولتر من وسط Opti-MEM منخفض المصل.إعداد مجمعات الحمض النووي الحويصلي عن طريق خلط البلازميد المخفف الخالي من الذيفان الداخلي مع Lipofectamine 2000 والسماح للخليط بالوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.نقل المجمعات بشكل منفصل إلى الخلايا في كل بئر وتخلط ببطء.بعد 4 ساعات، تم استبدال وسط زراعة الخلية بـ 2 مل من وسط RPMI 1640 الكامل واستمر الاستزراع لمدة 24 ساعة.تمت إضافة وسط زراعة الخلايا الطازجة إلى الخلايا واحتضانها لنقاط زمنية مختلفة اعتمادًا على تصميم الفحص.
تم تحضير عينات البروتين من المواد الطافية ومحلولات الخلية كما هو موضح سابقًا [25].كانت معلمات نقل الغشاء لـ pro-IL-1β وpro-caspase-1 وcaspase-1 p20 وNLRP3 وβ-actin وHis-tag 200 مللي أمبير/90 دقيقة.بالنسبة للإنترلوكين 1β (IL-1β؛ أنظمة البحث والتطوير، مينيابوليس، مينيسوتا، الولايات المتحدة الأمريكية)، caspase-1 (p20) (Adipogen، سويسرا) وNLRP3 (Adipogen SA، Epalinges، سويسرا) و1:5000 يستهدفان علامته (Amylet Scientific، ووهان، الصين) و act-actin (بروتينتك، ووهان، الصين).
تم إجراء الارتباط المتقاطع مع مادة ديسوكسينيميد الفرعية (DSS) كما هو موضح سابقًا [26].تم غسل الخلايا 3 مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد وتم التخلص منها بالكامل باستخدام إبرة قياس 27 في 50 ميكرولتر من محلول تفاعل ASC (الرقم الهيدروجيني 8.0) الذي يحتوي على 25 ملي مولار Na2PO4 و 187.5 ملي كلوريد الصوديوم و 25 ملي مولار HEPES و 125 ملي مولار NaHCO3.تم الطرد المركزي للخليط عند 5000 جم لمدة 3 دقائق وتم خياطة الحبيبة بـ 10 ميكرولتر DSS (25 مم في DMSO) و40 ميكرولتر من محلول التفاعل ASC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.بعد الطرد المركزي عند 5000 جم لمدة 10 دقائق، تم إذابة الحبيبة في محلول مكون من 40 ميكرولتر من محلول التفاعل ASC و10 ميكرولتر من محلول تحميل البروتين 6x (TransGen، بكين، الصين)، ثم تم إخماد المحلول عند درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. دقيقة.، ثم يغلى لمدة 10 دقائق.تم بعد ذلك إخضاع عينات البروتين للنشاف الغربي باستخدام الأجسام المضادة الأولية لـ ASC (Wanleibio، Shenyang، China) بنسبة تخفيف قدرها 1: 500.
باتباع الإجراء الموصوف مسبقًا [13]، تم حصاد المواد الطافية لثقافة الخلية وتم تحديد إفراز السيتوكين المؤيد للالتهابات IL-1β باستخدام مجموعة IL-1 Beta ELISA الخاصة بالماوس (Invitrogen، Thermo Fisher Scientific).تحويل قيم OD450nm إلى تركيزات البروتين باستخدام المنحنى القياسي IL-1β.
تم غسل الخلايا المطلية على ساترة بلطف 3 مرات في برنامج تلفزيوني دافئ، مثبت في مثبت خلايا الأنسجة (Biosharp، بكين، الصين) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT)، في 0.1٪ Triton X-Permeabilize عند 100 (مخفف في PBS؛ Biosharp ) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وكتلة 5٪ من ألبومين المصل البقري (في برنامج تلفزيوني) لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة.تم بعد ذلك تحضين الخلايا طوال الليل عند 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية ضد ASC (التخفيف 1:100) أو NLRP3 (التخفيف 1:100)، على التوالي، وCy3 المسمى الماعز المضاد للأرنب IgG(H+L) (1:400؛ EarthOx ، سان فرانسيسكو ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) أو IgG المضاد للفأر المترافق مع FITC (1: 400 ؛ إيرثوكس) طوال الليل عند 37 درجة مئوية في الظلام لمدة ساعة واحدة.تم تلوين النواة بـ Hoechst 33258 (10 ميكروغرام / مل ؛ UE ، سوتشو ، الصين) لمدة 5 دقائق وتم ملاحظتها تحت المجهر الفلوري (شركة أوليمبوس ، طوكيو ، اليابان).
تم تقسيم الفئران إلى أربع مجموعات (ن = 7 في كل مجموعة): (ط) مجموعة المراقبة السلبية المعالجة بـ PBS (PBS فقط؛ تزقيمية 100 ميكرولتر / فأر PBS متبوعة بالحقن اليومي داخل الصفاق 100 ميكرولتر / فأر PBS بعد 3 ساعات).، بشكل مستمر لمدة 7 أيام)؛(2) مجموعة مراقبة سلبية تعامل مع مثبط MCC950 [27] (100 ميكرولتر / فأر عبر أنبوب PBS، بعد 3 ساعات، 10 ملغم / كغم من وزن الجسم [BW] MCC950 [في PBS] كانت تدار داخل الصفاق يوميًا، لمدة 7 أيام)؛(ثالثا) مجموعة عدوى كيسة الاثني عشر (1.5 × 106 كيسة / فأر عن طريق التزقيم، بعد 3 ساعات، 100 ميكرولتر / فأر PBS تدار داخل الصفاق يوميًا لمدة 7 أيام)؛(4) مجموعة علاج مثبطات G. Duodenalis للعدوى مجتمعة بمثبط MCC950 (1.5 × 106 كيسة / فأر عبر الأنبوب، 10 مجم / كجم من وزن الجسم MCC950 داخل الصفاق يوميًا لمدة 7 أيام في 3 ساعات).تمت مراقبة وزن الجسم لكل فأر يوميًا وتم الموت الرحيم لجميع الفئران في اليوم السابع.تم تقطيع الاثني عشر المحصود (بطول 3 سم) إلى قطع صغيرة في 1 مل من برنامج تلفزيوني، وتم تدمير الخراجات طوال الليل في برنامج تلفزيوني عند 4 درجات مئوية، و G. duodenalis trophozoites.تم عزل الاثني عشر الطازج (طوله 1 سم) لتلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوسين (H&E).
تم تقسيم الفئران إلى مجموعتين: (1) مجموعة التحكم MOCK و (2) مجموعة مثبطات MCC950.كانت هناك خمس علاجات في كل مجموعة (ن = 7 / مجموعة علاج): (1) مجموعة التحكم السلبية للعلاج PBS (PBS فقط؛ 100 ميكرولتر / فأر PBS، الحقن العضلي (IM) (الظنبوبي الأمامي) [28، 29]؛( ب) pcDNA3.1(+) مجموعة المراقبة السلبية البلازميد (100 ميكروغرام/ماوس الحمض النووي، عن طريق الحقن العضلي)؛ (ثالثا) مجموعة السيطرة الإيجابية لعدوى الكيس الاثني عشري (1.5 × 106 الخراجات / الماوس، عن طريق أنبوب تزقيمي) (رابعا) أ مجموعة عولجت بالبلازميد pcDNA3.1(+)-alpha-2 (100 ميكروغرام/فأر DNA، عن طريق الحقن العضلي)، و(v) مجموعة عولجت بالبلازميد pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 (100 ميكروغرام/فأر الحمض النووي، بعد 12 ساعة من المرور، تلقت الفئران في مجموعة مثبط MCC950 حقنة يومية داخل الصفاق من MCC950 (10 ملغم / كغم من وزن الجسم) لمدة 7 أيام، بينما تلقت الفئران في مجموعة MOCK حجمًا متساويًا من علاج PBS. تم جمع عينات المصل من مقل العيون وتركها طوال الليل عند 4 درجات مئوية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وقياسات مستويات IL-1β.
تم تقسيم خمسة وثلاثين فأرًا إلى خمس مجموعات (العدد = 7/مجموعة).كانت المجموعة 1 عبارة عن مجموعة مراقبة سلبية عولجت بـ PBS: تلقت الفئران 100 ميكرولتر من PBS عضليًا وبعد 3 أيام عن طريق التزقيم.المجموعة 2 هي مجموعة مراقبة إيجابية مصابة بكيسات G. الاثني عشر: تم حقن الفئران بـ 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، وبعد 3 أيام تم حقن 1.5 × 106 كيسة/فأر داخل المعدة.المجموعة الثالثة - التحصين البلازميد باستخدام pcDNA3.1(+) بالاشتراك مع مجموعة مراقبة لعدوى كيس الاثني عشر: تلقت الفئران 100 ميكروغرام من DNA البلازميد pcDNA3.1(+)(im) عن طريق الفم، 1.5×106 كيسة/ فأر 3 لعدة مرات أيام.كانت المجموعتان 4 و5 عبارة عن بلازميد جياردين pcDNA3.1(+)-alpha-2 أو pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جياردين بلازميد مع عدوى كيسة G. duodenalis.المجموعة التجريبية: تلقت الفئران 100 ميكروغرام من PCDNA3.1 (+) - DNA البلازميد الجيارديني (im)، ثم بعد 3 أيام، تم حقن 1.5 × 106 كيسة / فأر عبر أنبوب تزقيمي.تمت مراقبة وزن الجسم لكل فأر بعد إدخال كيس G. duodenalis عبر الأنبوب.تم جمع الاثني عشر الطازج لقياسات الحمل الطفيلي وتحليل تلطيخ HE.
تم تحليل التغيرات النسيجية المرضية وفقًا للإجراء المنشور مسبقًا [30].تم تثبيت الاثني عشر الطازج باستخدام مثبت خلايا الأنسجة، وجزءا لا يتجزأ من البارافين، مقطعة إلى أقسام 4 ميكرون، ملطخة بـ H&E وتحليلها تحت المجهر الضوئي.تم تقييم التغيرات المرضية التمثيلية في سبعة أقسام من الأنسجة من سبعة فئران مستقلة من قبل أخصائي علم الأمراض غير المدرك للعلاج وتم التقاطها بتكبير 200x.تم قياس طول الزغابات وعمق الخبايا وفقًا للطرق الموصوفة مسبقًا .
تم الحصول على النتائج في المختبر وفي الجسم الحي في ثلاث نسخ.تم إنشاء الرسوم البيانية باستخدام GraphPad Prism 7.00 (GraphPad Software Inc.، La Jolla، CA، USA).تم تحليل الاختلافات بين مجموعتين بواسطة اختبار t، بينما تم تحليل الاختلافات بين مجموعات ≥3 من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) باستخدام برنامج SPSS (الإصدار 22.0؛ SPSS IBM Corp.، Armonk، NY، USA).تم تحليل البيانات من أجل تجانس التباين باستخدام اختبار ليفين متبوعًا باختبار Bonferroni اللاحق (B).يتم التعبير عن الأهمية كـ P <0.05 و P <0.01 و P <0.001 (ليست مهمة [ns]) (P > 0.05).
أظهر تحليلنا السابق لبروتينات GEV في موسوعة كيوتو للجينات والجينوم (KEGG) أن العديد من الأهداف قد تكون متورطة في تنشيط مسارات الإشارات الالتهابية [13].لقد اخترنا هدفين واعدين، alpha-2 وalpha-7.3 giardins، لتضخيم هذه الجزيئات واستخدامها لبناء ناقل التعبير حقيقي النواة pcDNA3.1(+).بعد التسلسل، تم نقل بلازميدات تعبير الجياردين المؤتلف pcDNA3.1(+)-alpha-2 وalpha-7.3 إلى البلاعم البريتونية الأولية للماوس، وتم تحديد البروتين المميز للالتهاب caspase-1 p20 (جزء من caspase-1 المنشط). كتوضيح الجزيئات الرئيسية التي يمكن أن تسبب الالتهاب.أظهرت النتائج أن الجياردين alpha-2 و alpha-7.3 يمكن أن يحفزوا تعبير p20 caspase-1 مشابهًا لـ GEV.لم يتم العثور على أي تأثير على تنشيط caspase-1 في التحكم السلبي غير المعالج (PBS فقط) والتحكم في البلازميد pcDNA3.1(+) (الشكل 1).
قياس تنشيط p20 caspase-1 بواسطة pcDNA3.1(+)-alpha-2 وalpha-7.3 giardins.تم نقل بلازميدات التعبير حقيقية النواة المؤتلفة pcDNA3.1(+)-alpha-2 وalpha-7.3 giardines (فوق كل حارة) إلى البلاعم البريتونية الأولية للماوس وتم حصاد طاف الثقافة بعد 24 ساعة.تم استخدام النشاف الغربي لقياس مستويات التعبير عن بروتين الالتهاب caspase-1 p20.تم استخدام مجموعة العلاج PBS فقط (الخط C) ومجموعة العلاج الأحادي pcDNA3.1 (+) (خط pcDNA3.1) كعنصر تحكم سلبي، وتم استخدام مجموعة العلاج GEV كعنصر تحكم إيجابي.تم تأكيد التعبير عن البروتين المؤتلف من خلال الكشف عن علامة الهيستيدين في كل بروتين، وكانت نطاقات البروتين المتوقعة هي ألفا -2 جياردين (38.2 كيلو دالتون) وألفا -7.3 جياردين (37.2 كيلو دالتون).GEV، الحويصلات خارج الخلية الجيارديا الاثني عشر، pcDNA3.1 (+)، ناقل خطي EcoRV، SUP، طاف
لتحديد ما إذا كان alpha-2 giardine وalpha-7.3 giardine يحفزان تعبير p20 caspase-1 ويلعبان دورًا في تنشيط الاستجابة الالتهابية للمضيف NLRP3، pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine وpcDNA3.1(+)-alpha تم نقل -7.3 جياردين إلى بلاعم الصفاق الأولية للفأر مع DNA البلازميد المؤتلف، وتم تحديد مستويات التعبير والتوطين واحتكار البروتينات الالتهابية الرئيسية NLRP3.في هذه التجربة، تم استخدام GEV كمجموعة مراقبة إيجابية، وكانت مجموعة العلاج بدون علاج (PBS فقط) أو مجموعة علاج ترنسفكأيشن pcDNA3.1(+) هي المجموعة السلبية.أظهرت النتائج أنه، كما هو الحال في مجموعة GEV، أدى الحمض النووي البلازميد المؤتلف لـ giardin pcDNA3.1(+)-alpha-2 وgiardin pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 إلى تنظيم NLRP3 وpro-IL-1β و تفعيل procaspase-1 و caspase-1 (الشكل 2 أ).بالإضافة إلى ذلك، تسبب كلا الجياردين في إفراز IL-1β كبير (pcDNA3.1: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P = 0.1000؛ alpha-2 giardine: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P = 0.0007 ).;ألفا -7.3 جياردين: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P<0.0001؛GEV: ANOVA، F(4، 10) = 1.625، P = 0.0047) (الشكل 2ب).كانت معظم بروتينات ASC أحادية في مجموعة عدم العلاج أو في مجموعة العلاج المنقولة بواسطة البلازميد pcDNA3.1(+)، على عكس pcDNA3.1(+)-alpha-2 أو pcDNA3.1(+)-alpha- 7.3 الجياردين.حدث احتكار القلة ASC في الحمض النووي البلازميد المؤتلف لمجموعة أو مجموعة التحكم الإيجابية GEV، مما يظهر شكل قليل القسيم (الشكل 2 ج).تشير هذه البيانات الأولية إلى أن ألفا -2 جياردين وألفا -7،3 جياردين يمكن أن يحفزا تنشيط الالتهاب NLRP3.أظهرت دراسات الفلورسنت المناعي اللاحقة لتوطين ASC وNLRP3 أنه في مجموعة التحكم السلبية، كان بروتين ASC منتشرًا في جميع أنحاء السيتوبلازم وظهر كإشارة نقطية عند تحفيز pcDNA3.1(+)-alpha-2 مع الجياردين أو pcDNA3.1 (+) -alpha-7،3 مجموعة الجياردين أو مجموعة التحكم الإيجابية GEV (الشكل 2 د).في مجموعات التحكم السلبي ومجموعات PCDNA 3.1 المعالجة بالبلازميد، لم يتم الكشف عن إشارة البروتين NLRP3، في حين أن نقطة إشارة الفلورسنت استجابة لـ pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine أو pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 تم التحقق..تم العثور على الجياردين في السيتوبلازم أو عند تحفيز HEV (الشكل 2 هـ).توضح هذه البيانات أيضًا أن G. duodenalis giardin alpha-2 وgiardin alpha-7.3 ينشطان الجسيم الالتهابي NLRP3 في البلاعم البريتونية الأولية للماوس.
يقوم pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin وpcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin بتنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3 في البلاعم البريتونية الفأرية.Transfect بلازميدات التعبير حقيقية النواة المؤتلف pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardin وpcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardin إلى الخلايا الضامة البريتونية الأولية والخلايا، أو حصاد المادة طافية خلال 24 ساعة لتحليل التعبير، احتكار القلة ، إفراز.وتوطين البروتينات الالتهابية الرئيسية.تم استخدام مجموعة PBS فقط (C) ومجموعة العلاج الفردية pcDNA3.1(+) كعنصر تحكم سلبي، وتم استخدام مجموعة العلاج GEV كمجموعة إيجابية.تم اكتشاف البروتينات الالتهابية الرئيسية NLRP3، بما في ذلك NLRP3 وpro-IL-1β وpro-caspase-1 وp20 caspase-1، بواسطة النشاف الغربي.ب تم تحديد مستويات إفراز IL-1β في المواد الطافية باستخدام مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA).تم تحليل الاختلافات بين المجموعتين الضابطة والتجريبية من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) باستخدام إصدار برنامج SPSS 22.0.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة بين المجموعتين ** P <0.01 و *** P <0.001.تم تحديد مستويات احتكار القلة ASC في الكريات من خلال تحليل الارتباط المتبادل DSS، في حين تم استخدام مستويات ASC في lysates الخلية كعنصر تحكم في التحميل.د تصور توطين مركز الدراسات الدولي باستخدام التألق المناعي.تم استخدام التألق المناعي لتصور توطين NLRP3.ASC، البروتين الشبيه بالبقع المبرمج؛إيل، انترلوكين.NLRP3 ، مستقبلات تشبه القلة المرتبطة بالنيوكليوتيدات 3 ؛نانوثانية، ليست كبيرة (P > 0.05)
يقوم كل من G. duodenalis و GEVs الذي يفرزه بتنشيط NLRP3 inflammasome وينظم الاستجابات الالتهابية للمضيف في المختبر.وبالتالي، فإن دور الجسيم الالتهابي NLRP3 في التسبب في بكتيريا G. duodenalis لا يزال غير واضح.للتحقيق في هذه المشكلة، قمنا بتصميم تجربة بين الفئران المصابة بكيس G. الاثني عشر والفئران المصابة بكيس G. الاثني عشر + علاج مثبط MCC950 ومقارنة التعبير الالتهابي NLRP3 عند الإصابة بكيس G. الاثني عشر.يظهر مخطط تفصيلي للتجربة في الشكل 3 أ.تمت مراقبة التغيرات في وزن الجسم لدى الفئران في مجموعات علاجية مختلفة لمدة 7 أيام بعد الإصابة بالكيسات، وتظهر النتائج في الشكل 3 ب.بالمقارنة مع المجموعة المعالجة ببرنامج تلفزيوني نقي، أظهرت النتائج أن (1) وزن جسم الفئران المصابة بكيس G. duodenalis انخفض من اليوم 3 إلى اليوم 7 بعد الإصابة؛(2) لم يكن للعلاج بمثبط MCC950 أي تأثير كبير على وزن جسم الفئران..بالمقارنة مع مجموعة العدوى الفردية، انخفض وزن الجسم في مجموعة عدوى الاثني عشر المعالجة بـ MCC950 بدرجات متفاوتة (اليوم 1: ANOVA، F(3، 24) = 1.885، P = 0.0148؛ اليوم 2: ANOVA، F(3، 24) ) = 0.4602، P <0.0001؛ اليوم 3: ANOVA، F (3، 24) = 0.8360، P = 0.0010؛ اليوم 4: ANOVA، F (3، 24) = 1.683، P = 0.0052؛ (3، 24) = 0.6497، P = 0.0645؛ اليوم 6: ANOVA، F (3، 24) = 5.457، P = 0.0175؛ اليوم 7: ANOVA، F (3، 24) = 2.893، P = 0.0202).توضح هذه البيانات أن الجسيم الالتهابي NLRP3 يحمي الفئران من فقدان الوزن بشكل كبير في المراحل المبكرة (2-4 أيام) من عدوى الاثني عشر.نحن بعد ذلك نهدف إلى اكتشاف G. duodenalis trophozoites في سائل غسل الاثني عشر وتظهر النتائج في الشكل 3 ج.بالمقارنة مع مجموعة عدوى كيسة G. الاثني عشر، زاد عدد الجوائز في الاثني عشر بشكل ملحوظ بعد حجب الجسيم الالتهابي NLRP3 (t(12) = 2.902، P = 0.0133).أظهرت أنسجة الاثني عشر الملطخة بـ HE، مقارنة بالتحكم السلبي المعالج بـ PBS وMCC950 وحدهما: (i) أدت عدوى كيس G. duodenalis إلى تلف الزغابات الاثني عشرية (ANOVA، F (3، 24) = 0.4903، P = 0.0488 ) وضمور سرداب (ANOVA، F(3، 24) = 0.4716، P = 0.0089)؛(2) الاثني عشر من الفئران المصابة بكيسات G. duodenalis وتم علاجها بمثبطات MCC950.تعرضت الزغابات الاثني عشر للتلف والموت (ANOVA، F (3، 24) = 0.4903، P = 0.0144) مع ضمور وتفرع سرداب (ANOVA، F (3، 24) = 0.4716، P = 0، 0481) (الشكل ثلاثي الأبعاد- F) .تشير هذه النتائج إلى أن الجسيم الالتهابي NLRP3 يلعب دورًا في تقليل إمراضية بكتيريا الاثني عشر.
دور الجسيم الالتهابي NLRP3 في عدوى الجيارديا الاثني عشر.تم تعقيم الفئران (رابعًا) باستخدام كيسات المكورات الاثني عشرية ثم تم علاجها باستخدام أو بدون MCC950 (ip).واستخدمت مجموعات العلاج واحدة مع برنامج تلفزيوني أو MCC950 كعناصر تحكم.المجموعة التجريبية ونظام العلاج.ب تمت مراقبة وزن جسم الفئران في كل مجموعة من مجموعات العلاج المختلفة لمدة 7 أيام.تم تحليل الفرق بين مجموعة عدوى G. duodenalis ومجموعة علاج العدوى G. duodenalis + MCC950 بواسطة اختبار t باستخدام إصدار برنامج SPSS 22.0.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة عند * P <0.05 أو ** P <0.01 أو *** P <0.001.ج تم تحديد الحمل الطفيلي عن طريق حساب عدد الجوائز في سائل غسل الاثني عشر.تم تحليل الفرق بين مجموعة عدوى G. duodenalis ومجموعة علاج العدوى G. duodenalis + MCC950 بواسطة اختبار t باستخدام إصدار برنامج SPSS 22.0.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة عند * P <0.05.د نتائج تلطيخ الهيماتوكسيلين ويوزين (H&E) من التشريح المرضي للاثني عشر.تشير الأسهم الحمراء إلى تلف الزغب، وتشير الأسهم الخضراء إلى تلف الخبايا.شريط النطاق: 100 ميكرومتر.e، f التحليل الإحصائي لارتفاع زغابة الاثني عشر وارتفاع سرداب الماوس.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة عند * P <0.05 و ** P <0.01.النتائج مأخوذة من 7 تجارب بيولوجية مستقلة.وزن الجسم، وزن الجسم؛IG، طريق الولادة داخل المعدة.الملكية الفكرية، طريق التسليم داخل الصفاق.ns، ليست كبيرة (P > 0.05)؛برنامج تلفزيوني، الفوسفات مخزنة المالحة؛وت، النوع البري
يعد إفراز IL-1β السمة المميزة لتنشيط الالتهاب.لتحديد ما إذا كان G. duodenalis alpha-2 giardine و alpha-7.3 giardine ينشطان مضيف NLRP3 الالتهابي في الجسم الحي، استخدمنا فئران WT غير المعالجة (مجموعة وهمية) والفئران المحظورة بالالتهاب NLRP3 (مجموعة العلاج المثبطة MCC950).يظهر مخطط تفصيلي للتجربة في الشكل 4 أ.تتألف المجموعات التجريبية من الفئران المعالجة بـ PBS، وعلاج كيسة G. duodenalis عن طريق التزقيم، والحقن العضلي لـ pcDNA3.1، والحقن العضلي لـ pcDNA3.1(+)-alpha-2 جياردين أو pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين.في اليوم السابع بعد الإعطاء العضلي للبلازميد المؤتلف، تم جمع المصل وتحديد مستوى IL-1β في كل مجموعة.كما هو مبين في الشكل 4 ب، في مجموعة MOCK: (i) مقارنة بمجموعة PBS، لم يكن للعلاج pcDNA3.1 أي تأثير كبير على إفراز IL-1β (ANOVA، F(4.29)=4.062، P=0.9998)، ومع ذلك، كان إفراز IL-β مرتفعًا بشكل ملحوظ في مجموعة كيسة G. duodenalis (ANOVA، F (4، 29) = 4.062، P = 0.0002)، (ii) pcDNA3.1-alpha-2 giardine وpcDNA3.1- الحقن العضلي لـ alpha-7.3 جياردين أدى إلى زيادة ملحوظة في مستويات IL-1β في المصل (ANOVA, F(4, 29) = 4.062, P<0.0001);(ثالثًا) PCDNA3.1-alpha-7,3 جياردين يسبب مستويات عالية من إفراز IL -1β في مجموعة الحقن العضلي pcDNA3.1-alpha-2 جياردين (ANOVA، F(4، 29) = 4.062، P = 0.0333) .مقارنة بكل مجموعة في مجموعة العلاج MCC950 ومجموعة MOCK: (1) انخفضت مستويات إفراز IL-1β في مجموعة التحكم PBS ومجموعة التحكم pcDNA3.1 إلى حد ما بعد حظر مثبط MCC950، لكن الفرق لم يكن كذلك كبير (PBS: ANOVA، F (9، 58) = 3.540، P = 0.4912 pcDNA3.1: ANOVA، F (9، 58) = 3.540، P = 0.5949)؛(2) بعد حظر MCC950.، تم تقليل إفراز IL-1β بشكل ملحوظ في المجموعة المصابة بكيس G. duodenalis، ومجموعة الجياردين pcDNA3.1-alpha-2، ومجموعة الجياردين pcDNA3.1-alpha-7.3 (G. duodenalis: ANOVA، F (9) ، 58) = 3.540، P = 0.0120؛ pcDNA3.1-alpha-2 جياردين: ANOVA، F(9، 58) = 3.540، P = 0.0447؛ pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين: ANOVA، F(9، 58) ) = 3.540، ف = 0.0164).تشير هذه النتائج إلى أن ألفا -2 جياردين وألفا -7.3 جياردين يتوسطان في تنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3 في الجسم الحي.
pcDNA3.1 (+) - تعمل الجياردين على تنشيط مضيف NLRP3 الملتهب في الجسم الحي.تم تحصين الفئران (IM) باستخدام بلازميد التعبير حقيقي النواة PCDNA3.1(+)-alpha-2 جياردين أو pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جياردين ثم تم علاجه بـ MCC950 (ip؛ مجموعة MCC950) أو لا (مجموعة وهمية ).تم استخدام مجموعة علاج البلازميد PBS أو pcDNA3.1(+) كعنصر تحكم سلبي، وتم استخدام مجموعة علاج كيس G. duodenalis كعنصر تحكم إيجابي.المجموعة التجريبية ونظام العلاج.ب تم قياس مستويات المصل لـ IL-1β في الفئران في اليوم السابع بواسطة اختبار ELISA.تم تحليل الاختلافات بين المجموعات في مجموعة MOCK باستخدام ANOVA أحادي الاتجاه، وتم تحليل الاختلافات بين مجموعة MOCK ومجموعة MCC950 باستخدام اختبار t لإصدار برنامج SPSS 22.0.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة بين مجموعات العلاج في مجموعة MOCK، * P <0.05 و *** P <0.001؛تشير علامات الدولار ($) إلى اختلافات كبيرة بين كل مجموعة في مجموعة MOCK ومجموعة MCC950 عند P <0.05.نتائج سبع تجارب بيولوجية مستقلة.i، الحقن العضلي، ns، غير مهم (P > 0.05)
للتحقيق في تأثير التنشيط بوساطة الجياردين alpha-2 وalpha-7.3 للمضيف الالتهابي NLRP3 على عدوى G. duodenalis، استخدمنا فئران WT C57BL/6 وحقننا alpha-2 giardine وalpha-7.3 giardine.تم حقن البلازميد في العضل، بعد 3 أيام من خلال الأنبوب المعدي لكيس G. duodenalis، وبعد ذلك تمت ملاحظة الفئران لمدة 7 أيام.يظهر مخطط تفصيلي للتجربة في الشكل 5 أ.تم قياس وزن الجسم لكل فأر يوميًا، وتم جمع عينات من أنسجة الاثني عشر الطازجة في اليوم السابع بعد تناوله من خلال أنبوب معدي، وتم قياس عدد الجوائز، ولوحظت التغيرات النسيجية.كما هو مبين في الشكل 5ب، مع زيادة وقت التغذية، زاد وزن الفئران في كل مجموعة تدريجياً.بدأت MT من الفئران في الانخفاض في اليوم الثالث بعد تناول الخراجات G. duodenalis داخل المعدة، ثم زادت تدريجياً.يؤدي تنشيط NLRP3 الالتهابي الناجم عن الحقن العضلي لـ alpha-2 giardine و alpha7.3 giardine إلى تخفيف فقدان الوزن بشكل كبير في الفئران (اليوم 1: pcDNA3.1-alpha-2 giardine، ANOVA، F (4، 30) = 1.399، P = 0.9754 يوم 1: pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين، ANOVA، F(4، 30) = 1.399، P = 0.9987 يوم 2: pcDNA3.1-alpha-2 جياردين، ANOVA، F (4، 30) = 0.3172، P = 0.9979؛ اليوم 2: pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين، ANOVA، F(4، 30) = 0.3172، P = 0.8409؛ يوم 3: pcDNA3.1-alpha-2 جياردين، ANOVA، F( 4، 30) = 0.8222، P = 0.0262 اليوم 3: pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين، ANOVA، F(4، 30) = 0.8222، P = 0.0083؛ يوم 4: pcDNA3.1-alpha-2 جياردين، ANOVA ، F (4، 30) = 0.5620، P = 0.0012، اليوم 4: pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين، ANOVA، F (4، 30) = 0.5620، P <0.0001، اليوم 5: pcDNA3.1-alpha - 2 جياردين، ANOVA، F(4، 30) = 0.9728، P <0.0001 اليوم 5: pcDNA3.1-alpha -7.3 جياردين، ANOVA، F(4، 30) = 0.9728، P <0.0001 اليوم 6: pcDNA3 .1 - ألفا -2 جياردين، أنوفا، F (4، 30) = 0.7154، P = 0.0012، اليوم 6: pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين، ANOVA، F (4، 30) = 0.7154، P = 0.0006؛اليوم 7: pcDNA3.1-alpha-2 جياردين، ANOVA، F(4، 30) = 0.5369، P<0.0001 اليوم 7: pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين، ANOVA، F(4، 30) = 0.5369، P <0.0001).تم تقييم الحمل الطفيلي في الاثني عشر (الشكل 5 ج).بالمقارنة مع السيطرة الإيجابية غير المعالجة والمجموعة التي تم حقنها باستخدام ناقل pcDNA3.1 الفارغ، انخفض عدد جوائز G. duodenalis بشكل ملحوظ في المجموعات التي تم حقنها بـ α-2 جياردين و α-7,3 جياردين (pcDNA3.1-alpha) -2 جياردين: ANOVA، F(3، 24) = 1.209، P = 0.0002، pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين: ANOVA، F(3، 24) = 1.209، P<0.0001).بالإضافة إلى ذلك، كان الجياردين ألفا-7.3 أكثر حماية في الفئران من الجياردين ألفا-2 (ANOVA، F(3، 24) = 1.209، P = 0.0081).تظهر نتائج تلطيخ HE في الشكل.5د-و.كان لدى الفئران التي تم حقنها بـ alpha-2 giardine و alpha-7.3 giardine عدد أقل من آفات أنسجة الاثني عشر، والتي تتجلى في تلف الزغابات، مقارنة بالفئران المحقونة بـ G. duodenalis والفئران المحقونة بـ G. duodenalis بالاشتراك مع ناقل pcDNA3 فارغ .1 تكبير.(pcDNA3.1-alpha-2 جياردين: ANOVA، F(3، 24) = 2.466، P = 0.0035 أو P = 0.0068؛ pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين: ANOVA، F(3، 24) = 2.466، P = 0.0028 أو P = 0.0055) وضمور سرداب مخفض (pcDNA3.1-alpha-2 جياردين: ANOVA، F(3، 24) = 1.470، P = 0.0264 أو P = 0.0158؛ pcDNA3.1-alpha-7.3 جياردين: ANOVA ، F(3, 24) = 1.470، P = 0.0371 أو P = 0.0191).تشير هذه النتائج إلى أن ألفا-2 جياردين وألفا-7،3 جياردين يقللان من عدوى بكتيريا الاثني عشر عن طريق تنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3 في الجسم الحي.
دور pcDNA3.1(+)-الجياردين في عدوى G. الاثني عشر.تم تحصين الفئران (IM) باستخدام بلازميدات التعبير حقيقية النواة المؤتلفة pcDNA3.1(+)-alpha-2 جياردين أو pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 جياردين ثم تم تحديها باستخدام كيسات G. duodenalis (ig).واستخدمت مجموعة برنامج تلفزيوني ومجموعة pcDNA3.1(+) + علاج كيسة الاثني عشر كمجموعات مراقبة سلبية، واستخدمت مجموعة علاج كيسة الاثني عشر كمجموعة مراقبة إيجابية.المجموعة التجريبية ونظام العلاج.ب تمت مراقبة MT من الفئران في كل مجموعة من مجموعات العلاج المختلفة لمدة 7 أيام بعد التحدي.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة بين المجموعات في مجموعة G. duodenalis ومجموعة الجياردين pcDNA3.1(+)-alpha-2، *P <0.05، **P <0.01، و***P <0.001؛تشير علامة الدولار ($) إلى وجود فرق كبير بين كل مجموعة من G. duodenalis ومجموعة pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 jardine، $$P<0.01 و$$P<0.001.ج تم تحديد الحمل الطفيلي عن طريق حساب عدد الطفيليات في 1 مل من غسل الاثني عشر من الاثني عشر (بطول 3 سم) والتعبير عنها بعدد الطفيليات لكل سم من الاثني عشر.تم تحليل الاختلافات بين مجموعة عدوى G. duodenalis ومجموعة pcDNA3.1(+)-alpha-2 giardine ومجموعة pcDNA3.1(+)-alpha-7.3 giardine بواسطة ANOVA أحادي الاتجاه باستخدام إصدار برنامج SPSS 22.0.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة عند ** P <0.01 و *** P <0.001.د التغيرات النسيجية المرضية في الاثني عشر.تشير الأسهم الحمراء إلى تلف الزغب، وتشير الأسهم الخضراء إلى تلف الخبايا.شريط النطاق: 100 ميكرومتر.e ، f التحليل الإحصائي لارتفاع زغبة الاثني عشر بالماوس ( e ) وارتفاع القبو ( f ).تم تحليل الاختلافات بين المجموعات في الشكل 1 د عن طريق تحليل التباين (ANOVA) أحادي الاتجاه باستخدام إصدار برنامج SPSS 22.0.تشير العلامات النجمية إلى اختلافات كبيرة عند * P <0.05 و ** P <0.01.نتائج سبع تجارب بيولوجية مستقلة.نانوثانية، ليست كبيرة (P > 0.05)
الجيارديا الاثني عشر هو طفيل معوي معروف لدى البشر والثدييات الأخرى يسبب داء الجيارديات.وفي عام 2004، تم إدراجه في مبادرة منظمة الصحة العالمية للأمراض المهملة بسبب ارتفاع معدل انتشاره على مدى 6 سنوات، وخاصة في المجتمعات ذات الوضع الاجتماعي والاقتصادي المنخفض [32].يلعب الجهاز المناعي الفطري دورًا حاسمًا في الاستجابة المناعية لعدوى G. duodenalis.تم الإبلاغ عن أن البلاعم الفأرية تبتلع وتقتل G. duodenalis عن طريق إطلاق مصائد خارج الخلية [33].أظهرت دراساتنا السابقة أن G. duodenalis، وهو طفيل خارج الخلية غير غزوي، ينشط مسارات الإشارات الالتهابية p38 MAPK وERK وNF-κB p65 وNLRP3 في بلاعم الفأر لتنظيم الاستجابات الالتهابية للمضيف، وقد يؤدي إطلاق GEV إلى تعزيز هذه العملية.13]، 24].ومع ذلك ، لا يزال يتعين توضيح PAMPs الدقيقة المشاركة في الالتهاب المنظم للالتهاب NLRP3 في GEV ودور NLRP3 الالتهابي في داء الجيارديات.ولتسليط الضوء على هذين السؤالين قمنا بهذه الدراسة.
يقع الجسيم الالتهابي NLRP3 في سيتوبلازم الخلايا المناعية ويمكن تنشيطه بواسطة جزيئات مختلفة مثل بلورات حمض اليوريك والسموم والبكتيريا والفيروسات والطفيليات.في الدراسات البكتيرية، تم تحديد السموم باعتبارها PAMPs الرئيسية التي تنشط أجهزة الاستشعار الالتهابية، مما يؤدي إلى الالتهاب وموت الخلايا [34].بعض السموم المتنوعة هيكليا، مثل الهيموليزين من المكورات العنقودية الذهبية [35] والإشريكية القولونية [36]، والهيموليزين BL (HBL) من السموم المعوية (NHE) [37]، تحفز على تنشيط التهاب NLRP3.أظهرت الدراسات الفيروسية أن بروتينات الفوعة مثل بروتين غلاف SARS-COV-2 (E) [38] وبروتين فيروس زيكا NS5 [39] هي PAMPs مهمة يتعرف عليها مستقبل NLRP3.في دراسات الطفيليات، تم الإبلاغ عن أن العديد من الطفيليات مرتبطة بتنشيط المضيف الالتهابي، مثل التوكسوبلازما جوندي، والمشعرة المهبلية [40]، والمثقبية الكروزية [41]، والليشمانيا [42].البروتينات الحبيبية الكثيفة GRA35 وGRA42 وGRA43، المرتبطة بضراوة التوكسوبلازما جوندي، مطلوبة لتحريض التهاب الحويصلات الهوائية في بلاعم الفئران لويس [43].بالإضافة إلى ذلك، ركزت بعض دراسات الليشمانيا على الجزيئات الفردية المشاركة في الجسيم الالتهابي NLRP3، مثل الغشاء الطفيلي الليبوفوسفوغليكان [44] أو إنزيم ميتالوبروتياز الزنك [45].من بين عائلة الجينات ألفا جياردين الشبيهة بالملحق، تبين أن ألفا -1 جياردين هو مرشح محتمل للقاح يوفر الحماية ضد بكتيريا الاثني عشر في نموذج الفأر [18].في دراستنا، اخترنا عوامل فوعة G. duodenalis ألفا 2 وألفا 7،3 جياردين، وهي فريدة من نوعها بالنسبة للجيارديا ولكن تم الإبلاغ عنها بشكل أقل نسبيًا.تم استنساخ هذين الجينين المستهدفين في ناقل نظام التعبير حقيقي النواة pcDNA3.1(+) لتحليل تنشيط الالتهاب.
في نموذج الفأر الخاص بنا، تعمل شظايا كاسباس المشقوقة كعلامات للتنشيط الالتهابي.عند التحفيز، يتفاعل NLRP3 مع ASC، ويقوم بتجنيد procaspases، ويولد caspases نشطة تلتصق pro-IL-1β وpro-IL-18 إلى IL-1β وIL-18 الناضجين، على التوالي -18.الكاسبيزات الالتهابية (caspases-1 و-4 و-5 و-11) هي عائلة محفوظة من بروتياز السيستين التي تعتبر ضرورية للدفاع الفطري وتشارك في الالتهاب وموت الخلايا المبرمج [46].يتم تنشيط Caspase-1 بواسطة الجسيمات الالتهابية المتعارف عليها [47]، بينما يتم تقسيم الكاسبيز-4 و-5 و-11 أثناء تكوين الجسيمات الالتهابية غير النمطية [48].في هذه الدراسة، استخدمنا البلاعم البريتونية الفأرية كنموذج وقمنا بالتحقيق في p20 caspase-1 المشقوق caspase-1 كعلامة على تنشيط التهاب المضيف NLRP3 في دراسات عدوى G. duodenalis.أظهرت النتائج أن العديد من ألفا جياردين مسؤولة عن التنشيط النموذجي للالتهاب، وهو ما يتوافق مع اكتشاف جزيئات الفوعة الرئيسية المرتبطة بالبكتيريا والفيروسات.ومع ذلك، فإن دراستنا ليست سوى شاشة أولية وهناك جزيئات أخرى يمكنها تنشيط الجسيمات الالتهابية غير الكلاسيكية، حيث وجدت دراستنا السابقة كلا من الجسيمات الالتهابية الكلاسيكية وغير الكلاسيكية في عدوى G. الاثني عشر [13].لتحديد ما إذا كان p20 caspase-1 الناتج مرتبطًا بالجسيم الالتهابي NLRP3، قمنا بنقل جياردين alpha-2 وalpha-7.3 إلى بلاعم البريتوني الفأرية لتحديد مستويات التعبير البروتيني للجزيء الرئيسي ومستويات احتكار القلة ASC، مما يؤكد أن كلا من α-giardins ينشطان الالتهاب NLRP3.تختلف نتائجنا قليلاً عن نتائج Manko-Prykhoda et al.، الذين أفادوا أن تحفيز خلايا Caco-2 باستخدام سلالات G. muris أو E. coli EPEC وحدها يمكن أن يزيد من كثافة مضان NLRP3 وASC وcaspase-1، وإن لم يكن بشكل كبير، في حين أن تقدير تكلفة G. muris وE. coli زاد من مستويات ثلاثة بروتينات [49].قد يكون هذا التناقض بسبب الاختلافات في اختيار أنواع الجيارديا وخطوط الخلايا والخلايا الأولية.لقد أجرينا أيضًا فحوصات في الجسم الحي باستخدام MCC950 في فئران WT C57BL/6 البالغة من العمر 5 أسابيع، والتي تكون أكثر عرضة للإصابة بـ G. duodenalis.MCC950 هو مثبط قوي وانتقائي لجزيء NLRP3 الصغير الذي يمنع تنشيط NLRP3 الكنسي وغير الكنسي بتركيزات النانومولية.يمنع MCC950 تنشيط NLRP3 ولكنه لا يؤثر على تنشيط مسارات الالتهابات AIM2 وNLRC4 وNLRP1 أو مسارات إشارات TLR [27].يحظر MCC950 تنشيط NLRP3 ولكنه لا يمنع بدء NLRP3، أو تدفق K+، أو تدفق Ca2+، أو التفاعل بين NLRP3 وASC؛بدلاً من ذلك، فهو يمنع تنشيط NLRP3 الالتهابي عن طريق منع احتكار قليلات ASC [27].لذلك، استخدمنا MCC950 في دراسة على الجسم الحي لتحديد دور الجسيم الالتهابي NLRP3 بعد حقن الجياردين.ينشط caspase-1 p10 السيتوكينات المؤيدة للالتهابات pro-IL-1β وpro-IL-18 إلى IL-1β وIL-18 الناضجين [50].في هذه الدراسة، تم استخدام مستويات IL-1β في مصل الفئران المعالجة بالجياردين مع أو بدون MCC950 كمؤشر على ما إذا كان الجسيم الالتهابي NLRP3 قد تم تنشيطه.كما هو متوقع، أدى العلاج بـ MCC950 إلى خفض مستويات IL-1β في المصل بشكل ملحوظ.توضح هذه البيانات بوضوح أن G. duodenalis giardin alfa-2 وgiardin alfa-7.3 قادران على تنشيط الجسيم الملتهب NLRP3.
أظهرت البيانات الهامة المتراكمة على مدى العقد الماضي أن IL-17A هو المنظم الرئيسي للمناعة ضد G. muris، حيث يحفز إشارات IL-17RA، وينتج الببتيدات المضادة للميكروبات، وينظم التنشيط التكميلي [51].ومع ذلك، تحدث عدوى الجيارديا بشكل متكرر أكثر عند البالغين الشباب، وقد تم الإبلاغ عن أن عدوى الجيارديا في الفئران الصغيرة لا تنشط استجابة IL-17A لممارسة تأثيرها الوقائي [52]، مما دفع الباحثين إلى البحث عن الجيارديات المعدلة للمناعة الأخرى.آليات الإصابة بالديدان الطفيلية.أفاد مؤلفو دراسة حديثة أن بكتيريا G. muris يمكنها تنشيط NLRP3 inflammasome بواسطة E. coli EPEC، مما يعزز إنتاج الببتيدات المضادة للميكروبات ويقلل من قدرتها على الارتباط وعدد الجوائز في القناة المعوية، وبالتالي يقلل من شدة القولون الأمراض التي تسببها العصيات [49] .ويشارك الجسيم الالتهابي NLRP3 في تطور أمراض مختلفة.أظهرت الدراسات أن الزائفة الزنجارية تؤدي إلى الالتهام الذاتي في الخلايا البلعمية لتجنب موت الخلايا، وتعتمد هذه العملية على تنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3 [53].بالنسبة إلى N. caninum، فإن التنشيط بوساطة أنواع الأكسجين التفاعلية للجسيم الالتهابي NLRP3 يحد من تكاثره في المضيف، مما يجعله هدفًا علاجيًا محتملاً [9].تم العثور على Paracoccidioides brasiliensis للحث على تنشيط NLRP3 inflammasome في الخلايا الجذعية المشتقة من نخاع عظم الفأر، مما يؤدي إلى إطلاق السيتوكين الالتهابي IL-1β، الذي يلعب دورًا حاسمًا في دفاع المضيف [10].تعمل العديد من أنواع الليشمانيا، بما في ذلك L. amazonensis وL. الكبرى وL. braziliensis وL. Infantum chagasi، على تنشيط NLRP3 وcaspase-1 المعتمد على ASC في البلاعم، بالإضافة إلى عدوى الليشمانيا.تم تعزيز تكاثر الطفيليات في الفئران الناقصة في جين NLRP3/ASC/caspase-1 [11].زامبوني وآخرون.تم الإبلاغ عن أن عدوى الليشمانيا تحفز تنشيط NLRP3 inflammasome في البلاعم، مما يحد من تكاثر الطفيليات داخل الخلايا.وبالتالي، فإن الليشمانيا قد تمنع تنشيط NLRP3 كإستراتيجية تجنب.في الدراسات التي أجريت على الجسم الحي، ساهم الجسيم الالتهابي NLRP3 في القضاء على الليشمانيا، لكنه لم يؤثر على الأنسجة [54].على العكس من ذلك، في دراسات داء الديدان الطفيلية، أدى تنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3 إلى قمع مناعة المضيف الوقائية ضد داء الديدان الطفيلية المعوية [12].الشيغيلة هي واحدة من البكتيريا الرئيسية المسببة للإسهال في جميع أنحاء العالم.يمكن لهذه البكتيريا أن تحفز إنتاج IL-1β من خلال تدفق K+ بوساطة مستقبلات P2X7، وأنواع الأكسجين التفاعلية، والتحمض الليزوزومي، وتلف الميتوكوندريا.ينظم الجسيم الالتهابي NLRP3 سلبًا البلعمة ونشاط مبيد الجراثيم للبلاعم ضد الشيجلا [55].أظهرت دراسات البلازموديوم أن الفئران التي تعاني من نقص AIM2 أو NLRP3 أو كاسباس 1 والمصابة بالبلازموديوم تنتج مستويات عالية من الإنترفيرون من النوع الأول وتكون أكثر مقاومة لعدوى البلازموديوم [56].ومع ذلك، فإن دور ألفا-2 جياردين وألفا-7.3 جياردين في تحفيز التنشيط الممرض لالتهاب NLRP3 في الفئران غير واضح.
في هذه الدراسة، أدى تثبيط الجسيم الالتهابي NLRP3 بواسطة MCC950 إلى تقليل وزن الجسم وزيادة عدد الجوائز في سائل غسل الأمعاء لدى الفئران، مما أدى إلى تغيرات مرضية أكثر شدة في أنسجة الاثني عشر.يقوم Alpha-2 giardine وalpha-7.3 giardine بتنشيط الجسيم الالتهابي NLRP3 للفأر المضيف، وزيادة وزن جسم الفأر، وتقليل عدد الجوائز في سائل غسل الأمعاء، وتخفيف آفات الاثني عشر المرضية.تشير هذه النتائج إلى أن G. duodenalis يمكنه تنشيط الجسيم الالتهابي المضيف NLRP3 عبر alpha-2 جياردين وalpha-7,3 جياردين، مما يقلل من إمراضية G. duodenalis في الفئران.
بشكل جماعي، توضح نتائجنا أن الجياردين alpha-2 وalpha-7.3 يحفزان تنشيط المضيف الالتهابي NLRP3 ويقللان من عدوى G. duodenalis في الفئران.لذلك، تعتبر هذه الجزيئات أهدافًا واعدة للوقاية من داء الجيارديات.
       Data supporting the results of this study can be obtained from the respective author at gongpt@jlu.edu.cn.
ليانغ أكس، ليانغ آم، هوانغ أهك، سيرجي كم، كام جكم.الجيارديا: نظرة عامة.تم الكشف مؤخرًا عن أن بات إنفلام يعاني من حساسية تجاه الأدوية.2019;13:134–43.
إسكوبيدو AA، تسيمرمان S. الجيارديا: مراجعة العلاج الدوائي.رأي الخبراء للصيدلي.2007;8: 1885-902.
تيان هوافنغ، تشن بن، ون جيان فنغ.الجيارديا ومقاومة الأدوية واكتشاف أهداف جديدة.يصيب أهداف المخدرات Disord.2010;10:295–302.
Wang Z، Zhang X، Xiao Yi، Zhang W، Wu X، Qin T، إلخ. NLRP3 الأمراض الالتهابية والالتهابية.أكسيد ميد خلية لونجيف.2020;2020:4063562.
Chen GY، Núñez G. دور الالتهاب في التهاب الأمعاء والسرطان.أمراض الجهاز الهضمي.2011؛141: 1986–99.
Pellegrini C، Antonioli L، Lopez-Castejon G، Blandizzi C، Fornai M. تنشيط الالتهاب NLRP3 الكنسي وغير النمطي عند مفترق طرق التسامح المناعي والتهاب الأمعاء.ما قبل المناعة.2017;8:36.
لي إل، وانغ إكس سي، قونغ بي تي، تشانغ إن، تشانغ إكس، لي إس، وآخرون.ويشارك تنشيط الالتهاب NLRP3 بوساطة ROS في الاستجابة لعدوى N. caninum.ناقلات الطفيليات.2020;13:449.