شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
Toxoplasma gondii هو طفيلي أولي داخل الخلايا ينظم البيئة المكروية للمضيف المصاب ومن المعروف أنه مرتبط بحدوث نمو ورم في المخ.في هذه الدراسة ، نفترض أن mRNA-21 الخارجي من عدوى التوكسوبلازما يعزز نمو ورم الدماغ.تم تمييز Exosomes من الخلايا الدبقية الصغيرة BV2 المصابة بالتوكسوبلازما وتأكد استيعاب خلايا الورم الدبقي U87.تم تحليل ملامح تعبير microRNA الخارجي باستخدام صفائف من microRNA و microRNA-21A-5p المرتبطة بالتوكسوبلازما جوندي وفرز الورم.لقد درسنا أيضًا مستويات mRNA للجينات المرتبطة بالورم في خلايا الورم الدبقي U87 عن طريق تغيير مستويات miR-21 في exosomes وتأثير exosomes على تكاثر خلايا U87 الدبقية البشرية.في exosomes لخلايا الورم الدبقي U87 المصابة بـ Toxoplasma gondii ، يزداد التعبير عن microRNA-21 ويقل نشاط الجينات المضادة للورم (FoxO1 و PTEN و PDCD4).تحفز exosomes المشتقة من BV2 المصابة بالتوكسوبلازما تكاثر خلايا الورم الدبقي U87.تحفز Exosomes نمو خلايا U87 في نموذج ورم الفئران.نقترح أن زيادة miR-21 الخارجية في الخلايا الدبقية المكروية BV2 المصابة بالتوكسوبلازما قد تلعب دورًا مهمًا كمحفز لنمو الخلايا في خلايا الورم الدبقي U87 عن طريق تقليل تنظيم الجينات المضادة للورم.
تشير التقديرات إلى أنه تم تشخيص أكثر من 18.1 مليون حالة من حالات السرطان المتقدم في جميع أنحاء العالم في عام 2018 ، مع تشخيص حوالي 297000 من أورام الجهاز العصبي المركزي كل عام (1.6٪ من جميع الأورام) 1.أظهرت الأبحاث السابقة أن عوامل الخطر لتطوير أورام الدماغ البشري تشمل المنتجات الكيميائية المختلفة ، والتاريخ العائلي ، والإشعاع المؤين من أجهزة الرأس العلاجية والتشخيصية.ومع ذلك ، فإن السبب الدقيق لهذه الأورام الخبيثة غير معروف.ما يقرب من 20 ٪ من جميع أنواع السرطان في جميع أنحاء العالم سببها عوامل معدية ، بما في ذلك الفيروسات والبكتيريا والطفيليات.تعطل مسببات الأمراض المعدية الآليات الجينية للخلية المضيفة ، مثل إصلاح الحمض النووي ودورة الخلية ، ويمكن أن تؤدي إلى التهاب مزمن وتلف الجهاز المناعي 5.
العوامل المعدية المرتبطة بسرطان الإنسان هي أكثر مسببات الأمراض الفيروسية شيوعًا ، بما في ذلك فيروسات الورم الحليمي البشري وفيروسات التهاب الكبد B و C.يمكن أن تلعب الطفيليات أيضًا دورًا محتملًا في تطور السرطان البشري.العديد من أنواع الطفيليات ، وهي البلهارسيا ، Opishorchis viverrini ، O. felineus ، Clonorchis sinensis و Hymenolepis nana ، قد تورطت في أنواع مختلفة من سرطان الإنسان 6،7،8.
التوكسوبلازما جوندي هو طفيلي داخل الخلايا ينظم البيئة المكروية للخلايا المضيفة المصابة.يُقدر أن هذا الطفيل يصيب ما يقرب من 30 ٪ من سكان العالم ، ويعرض جميع السكان للخطر.يمكن أن تصيب التوكسوبلازما جوندي الأعضاء الحيوية ، بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي (CNS) ، وتسبب أمراضًا خطيرة مثل التهاب السحايا القاتل والتهاب الدماغ ، وخاصة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة.ومع ذلك ، يمكن أن تغير التوكسوبلازما جوندي أيضًا بيئة المضيف المصاب عن طريق تعديل نمو الخلايا والاستجابات المناعية لدى الأفراد المؤهلين مناعياً ، مما يؤدي إلى الحفاظ على عدوى مزمنة بدون أعراض.ومن المثير للاهتمام ، نظرًا للعلاقة بين انتشار T. gondii ووقوع ورم الدماغ ، تشير بعض التقارير إلى أن التغيرات البيئية للمضيف في الجسم الحي بسبب عدوى T. gondii المزمنة تشبه البيئة المكروية للورم.
تُعرف Exosomes باسم أجهزة الاتصال بين الخلايا التي توفر محتوى بيولوجيًا ، بما في ذلك البروتينات والأحماض النووية ، من الخلايا المجاورة.يمكن أن تؤثر Exosomes على العمليات البيولوجية المتعلقة بالورم مثل مكافحة موت الخلايا المبرمج ، وتكوين الأوعية ، والورم الخبيث في البيئة المكروية للورم.على وجه الخصوص ، تعد miRNAs (miRNAs) ، وهي جزيئات RNA صغيرة غير مشفرة يبلغ طولها حوالي 22 نيوكليوتيدًا ، منظمات جينية مهمة بعد النسخ والتي تتحكم في أكثر من 30 ٪ من mRNA البشري من خلال مجمع الإسكات الناجم عن ميرنا (miRISC).يمكن أن تعطل التوكسوبلازما جوندي العمليات البيولوجية عن طريق التحكم في تعبير ميرنا في العوائل المصابة.تحتوي الجزيئات المجهرية المضيفة على إشارات مهمة لتنظيم العمليات البيولوجية للمضيف لتحقيق استراتيجية بقاء الطفيل.وبالتالي ، فإن دراسة التغييرات في ملف تعريف الحمض النووي للمضيف عند الإصابة بـ T. gondii يمكن أن يساعدنا في فهم التفاعل بين المضيف و T. gondii بشكل أكثر وضوحًا.في الواقع ، Thirugnanam et al.اقترح 15 أن T. gondii يشجع على تسرطن الدماغ عن طريق تغيير تعبيره على mRNAs مضيفة معينة مرتبطة بنمو الورم ووجد أن T. gondii يمكن أن يسبب أورام دبقية في حيوانات التجارب.
تركز هذه الدراسة على تغيير exosomal miR-21 في الخلايا الدبقية الصغيرة المضيفة المصابة بـ Toxoplasma BV2.لاحظنا دورًا محتملاً للـ miR-21 الخارجي المتغير في نمو خلايا الورم الدبقي U87 بسبب الاحتفاظ بنواة FoxO1 / p27 ، وهو هدف miR-21 المفرط التعبير.
تم الحصول على Exosomes المشتقة من BV2 باستخدام الطرد المركزي التفاضلي والتحقق من صحتها بطرق مختلفة لمنع التلوث بالمكونات الخلوية أو الحويصلات الأخرى.أظهر الرحلان الكهربائي للهلام SDS-polyacrylamide (SDS-PAGE) أنماطًا متميزة بين البروتينات المستخرجة من خلايا BV2 والإكسوسومات (الشكل 1A) ، وتم تقييم العينات لوجود Alix ، الذي تم تحليله عن طريق النشاف الغربي لعلامات البروتين الخارجي في.تم العثور على وسم أليكس في بروتينات exosome ولكن ليس في بروتينات الخلية المحللة BV2 (الشكل 1 ب).بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل الحمض النووي الريبي المنقى من exosomes المشتقة من BV2 باستخدام محلل بيولوجي.نادرًا ما لوحظت الوحدات الفرعية الريبوسومية 18S و 28S في نمط هجرة الحمض النووي الريبي الخارجي ، مما يشير إلى نقاء موثوق (الشكل 1C).أخيرًا ، أظهر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال أن الإكسوسومات المرصودة كان حجمها حوالي 60-150 نانومتر ولها هيكل يشبه الكوب نموذجي لمورفولوجيا الجسيمات الخارجية (الشكل 1 د).
توصيف exosomes المشتقة من خلايا BV2(أ) صفحة ورقة بيانات السلامة.تم عزل البروتينات من خلايا BV2 أو exosomes مشتقة من BV2.تختلف أنماط البروتين بين الخلايا والإكسوسومات.(ب) تحليل لطخة غربية لعلامة خارجية (أليكس).(ج) تقييم الحمض النووي الريبي المنقى من خلايا BV2 و BV2 exosomes المشتقة باستخدام محلل بيولوجي.وهكذا ، نادرًا ما تم العثور على وحدات فرعية 18S و 28S في خلايا BV2 في الحمض النووي الريبي الخارجي.(د) أظهر الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال أن exosomes المعزولة من خلايا BV2 كانت ملطخة سلبًا بنسبة 2 ٪ من أسيتات اليورانيل.يبلغ حجم Exosomes حوالي 60-150 نانومتر وشكل كوب (Song and Jung ، بيانات غير منشورة).
لوحظ الاستيعاب الخلوي للخلايا الخارجية المشتقة من BV2 في خلايا الورم الدبقي البشري U87 باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر.يتم ترجمة exosomes PKH26 المسمى في السيتوبلازم لخلايا U87.كانت النوى ملطخة بـ DAPI (الشكل 2 أ) ، مما يشير إلى أن الإكسوسومات المشتقة من BV2 يمكن استيعابها بواسطة الخلايا المضيفة والتأثير على بيئة الخلايا المتلقية.
تدخيل exosomes المشتقة من BV2 في خلايا الورم الدبقي U87 و exosomes المشتقة من BV2 المصابة بالتوكسوبلازما RH الناجم عن تكاثر خلايا الورم الدبقي U87.(أ) Exosomes غارقة بخلايا U87 تقاس بالفحص المجهري متحد البؤر.تم تحضين خلايا الورم الدبقي U87 مع exosomes المسمى بـ PKH26 (أحمر) أو بدون تحكم لمدة 24 ساعة.كانت النوى ملطخة بـ DAPI (أزرق) ثم تمت ملاحظتها تحت مجهر متحد البؤر (شريط المقياس: 10 ميكرون ، × 3000).(ب) تم تحديد تكاثر خلايا الورم الدبقي U87 عن طريق مقايسة تكاثر الخلايا.عولجت خلايا الورم الدبقي U87 باستخدام exosomes في الوقت المحدد. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب t. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب t. * P <0،05 получено по t-критерию Стьюдента. * P <0.05 بواسطة اختبار الطالب. * ف <0.05 通过 学生 ر 检验 获得。 * ف <0.05 * P <0،05، полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * تم الحصول على P <0.05 باستخدام اختبار الطالب.
بعد التأكد من استيعاب exosomes المستمدة من BV2 في خلايا الورم الدبقي U87 ، أجرينا فحوصات تكاثر الخلايا للتحقيق في دور exosomes المشتقة من التوكسوبلازما المشتقة من BV2 في تطوير خلايا الورم الدبقي البشري.أظهرت معالجة خلايا U87 مع exosomes من خلايا BV2 المصابة بـ T. gondii أن الإكسوسومات المشتقة من T. gondii المصابة بـ BV2 تسبب تكاثرًا أعلى بكثير لخلايا U87 مقارنةً بالتحكم (الشكل 2 ب).
بالإضافة إلى ذلك ، كان لنمو خلايا U118 نفس نتائج U87 ، حيث تسبب التوكسوبلازما في تحفيز exosomes تسبب في أعلى مستويات الانتشار (البيانات غير معروضة).بناءً على هذه البيانات ، يمكننا الإشارة إلى أن exosomes المصابة بالتوكسوبلازما المستمدة من BV2 تلعب دورًا مهمًا في تكاثر خلايا الورم الدبقي.
للتحقيق في تأثير exosomes المشتقة من التوكسوبلازما المصابة بـ BV2 على تطور الورم ، قمنا بحقن خلايا الورم الدبقي U87 في الفئران العارية لنموذج xenograft وحقننا exosomes المستمدة من BV2 أو exosomes المشتقة من BV2 المصابة بـ RH.بعد ظهور الأورام بعد أسبوع واحد ، تم تقسيم كل مجموعة تجريبية من 5 فئران وفقًا لحجم الورم لتحديد نقطة البداية نفسها ، وتم قياس حجم الورم لمدة 22 يومًا.
في الفئران مع نموذج طعم أجنبي U87 ، لوحظ حجم ووزن أكبر للورم في المجموعة الخارجية المصابة بالعدوى RH المشتقة من BV2 في اليوم 22 (الشكل 3 أ ، ب).من ناحية أخرى ، لم يكن هناك فرق كبير في حجم الورم بين المجموعة الخارجية المشتقة من BV2 ومجموعة التحكم بعد العلاج الخارجي.بالإضافة إلى ذلك ، أظهرت الفئران التي تم حقنها بخلايا ورم دبقي وإكسوسومات بصريًا أكبر حجم للورم في مجموعة الإكسوسومات المشتقة من فيروس BV2 المصابة بـ RH (الشكل 3C).توضح هذه النتائج أن exosomes المصابة بالتوكسوبلازما المشتقة من BV2 تحفز نمو الورم الدبقي في نموذج ورم الفأر.
تكون الأورام (AC) من exosomes المشتقة من BV2 في نموذج فأر U87 xenograft.تمت زيادة حجم الورم (A) والوزن (B) بشكل كبير في الفئران العارية BALB / c المعالجة بـ exosomes المصابة بـ RH المستمدة من BV2.تم حقن الفئران العارية BALB / c (C) تحت الجلد مع 1 × 107 خلية U87 معلقة في خليط Matrigel.بعد ستة أيام من الحقن ، تم علاج 100 ميكروغرام من exosomes المشتقة من BV2 في الفئران.تم قياس حجم ووزن الورم في الأيام المحددة وبعد الذبيحة على التوالي. * ف <0.05. * ف <0.05. * Р <0،05. * ف <0.05. * ف <0.05。 * ف <0.05。 * Р <0،05. * ف <0.05.
أظهرت البيانات أن 37 miRNAs (16 مفرط التعبير و 21 منخفض التعبير) المرتبطة بالمناعة أو تطور الورم قد تغيرت بشكل كبير في الخلايا الدبقية الصغيرة بعد الإصابة بسلالة Toxoplasma RH (الشكل 4 أ).تم تأكيد مستويات التعبير النسبي لـ miR-21 بين miRNAs المتغيرة بواسطة RT-PCR في الوقت الفعلي في exosomes المستمدة من BV2 ، exosomes المعالجة بخلايا BV2 و U87.أظهر التعبير عن miR-21 زيادة كبيرة في exosomes من خلايا BV2 المصابة بالتوكسوبلازما جوندي (سلالة RH) (الشكل 4 ب).زادت مستويات التعبير النسبي لـ miR-21 في خلايا BV2 و U87 بعد امتصاص exosomes المتغيرة (الشكل 4 ب).كانت المستويات النسبية لتعبير miR-21 في أنسجة المخ لمرضى الورم والفئران المصابة بالتوكسوبلازما جوندي (سلالة ME49) أعلى منها في المجموعة الضابطة ، على التوالي (الشكل 4 ج).ترتبط هذه النتائج بالاختلافات بين مستويات التعبير عن الرنا الميكروي المتوقع والمؤكدة في المختبر وفي الجسم الحي.
التغييرات في التعبير عن exosomal miP-21a-5p في الخلايا الدبقية الصغيرة المصابة بـ Toxoplasma gondii (RH).(أ) يوضح تغييرات مهمة في siRNA المرتبطة بالمناعة أو تطور الورم بعد عدوى T. gondii RH.(ب) تم الكشف عن مستويات تعبير miR-21 النسبية بواسطة RT-PCR في الوقت الحقيقي في exosomes المستمدة من BV2 ، و exosomes المعالجة بـ BV2 ، وخلايا U87.(C) تم العثور على مستويات تعبير miR-21 النسبية في أنسجة المخ لمرضى الورم (N = 3) والفئران المصابة بـ Toxoplasma gondii (سلالة ME49) (N = 3). * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب t. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب t. * P <0،05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * تم الحصول على P <0.05 باستخدام اختبار الطالب. * ف <0.05 通过 学生 ر 检验 获得。 * ف <0.05 * P <0،05، полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * تم الحصول على P <0.05 باستخدام اختبار الطالب.
أدت Exosomes من خلايا BV2 المصابة بـ RH إلى نمو الأورام الدبقية في الجسم الحي وفي المختبر (الشكل 2 ، 3).للكشف عن mRNAs ذات الصلة ، قمنا بفحص مستويات mRNA للجينات المستهدفة المضادة للورم ، و forkhead box O1 (FoxO1) ، و PTEN ، وموت الخلايا المبرمج 4 (PDCD4) في خلايا U87 المصابة بالإكسوسومات المستمدة من BV2 أو RH BV2.أظهر تحليل المعلوماتية الحيوية أن العديد من الجينات المرتبطة بالورم ، بما في ذلك جينات FoxO1 و PTEN و PDCD4 ، لها مواقع ربط miR-2121،22.تم تخفيض مستويات الرنا المرسال للجينات المستهدفة المضادة للورم في exosomes المشتقة من RH المصابة بـ BV2 مقارنةً بالإكسوسومات المشتقة من BV2 (الشكل 5 أ).أظهر FoxO1 انخفاض مستويات البروتين في exosomes المشتقة من RH المصابة بـ BV2 مقارنةً بـ exosomes المشتقة من BV2 (الشكل 5 ب).بناءً على هذه النتائج ، يمكننا أن نؤكد أن exosomes المستمدة من BV2 المصابة بـ RH تقلل من تنظيم الجينات المضادة للأورام ، وتحافظ على دورها في نمو الورم.
تحفز exosomes المشتقة من التوكسوبلازما RH المصابة بـ BV2 قمع الجينات المضادة للورم في خلايا الورم الدبقي U87 بواسطة exosomes المصابة بـ RH المصابة بـ BV2.(أ) PCR في الوقت الحقيقي لتعبير FoxO1 و PTEN و PDCD4 في exosomes المشتقة من T. gondii RH المصابة بـ BV2 مقارنةً بـ PBS exosomes.تم استخدام β-actin mRNA كعنصر تحكم.(ب) تم تحديد تعبير FoxO1 عن طريق النشاف الغربي وتم تقييم بيانات قياس الكثافة إحصائيًا باستخدام برنامج ImageJ. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب t. * تم الحصول على P <0.05 بواسطة اختبار الطالب t. * P <0،05 было получено с помощью t-критерия Стьюдента. * تم الحصول على P <0.05 باستخدام اختبار الطالب. * ف <0.05 通过 学生 ر 检验 获得。 * ف <0.05 * P <0،05، полученный с помощью t-критерия Стьюдента. * تم الحصول على P <0.05 باستخدام اختبار الطالب.
لفهم تأثير miP-21 في exosomes على تنظيم الجينات المرتبطة بالورم ، تم نقل خلايا U87 باستخدام مثبط لـ miP-21 باستخدام Lipofectamine 2000 وتم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من تعداء الخلايا.تمت مقارنة مستويات التعبير FoxO1 و p27 في الخلايا المنقولة باستخدام مثبطات miR-21 بالخلايا التي عولجت باستخدام exosomes مشتق من BV2 باستخدام qRT-PCR (الشكل 6 أ ، ب).ترنسفكأيشن لمثبط miR-21 إلى خلايا U87 قلل بشكل كبير من تنظيم تعبير FoxO1 و p27 (الشكل 6).
غيرت miP-21 المصابة بـ RH exosomal BV2 المشتق من التعبير FoxO1 / p27 في خلايا الورم الدبقي U87.تم نقل خلايا U87 باستخدام مثبط miP-21 باستخدام Lipofectamine 2000 وتم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من تعداء العدوى.تمت مقارنة مستويات التعبير FoxO1 و p27 في الخلايا المنقولة باستخدام مثبطات miR-21 مع المستويات الموجودة في الخلايا التي عولجت باستخدام exosomes مشتق من BV2 باستخدام qRT-PCR (A ، B).
للهروب من الاستجابة المناعية للمضيف ، يتحول طفيلي التوكسوبلازما إلى كيس نسيج.تتطفل على الأنسجة المختلفة ، بما في ذلك الدماغ والقلب والعضلات الهيكلية ، طوال عمر المضيف وتعديل الاستجابة المناعية للمضيف.بالإضافة إلى ذلك ، يمكنهم تنظيم دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج للخلايا المضيفة ، مما يعزز تكاثرها.تصيب التوكسوبلازما جوندي في الغالب الخلايا المتغصنة المضيفة ، والعدلات ، ونسب الخلية الوحيدة / البلاعم ، بما في ذلك الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ.تحث التوكسوبلازما جوندي على تمايز الضامة من النمط الظاهري M2 ، وتؤثر على التئام الجروح بعد عدوى الممرض ، وترتبط أيضًا بفرط الأوعية الدموية والتليف الحبيبي.قد يكون هذا التسبب السلوكي لعدوى التوكسوبلازما مرتبطًا بعلامات مرتبطة بتطور الورم.قد تشبه البيئة المعادية التي تنظمها التوكسوبلازما محتمل التسرطن المقابل.لذلك ، يمكن افتراض أن عدوى التوكسوبلازما يجب أن تساهم في تطور أورام المخ.في الواقع ، تم الإبلاغ عن معدلات عالية من عدوى التوكسوبلازما في مصل المرضى الذين يعانون من أورام الدماغ المختلفة.بالإضافة إلى ذلك ، قد تكون التوكسوبلازما جوندي من العوامل المسببة للسرطان وتعمل بشكل تآزري لمساعدة مسببات السرطان المعدية الأخرى على تطوير أورام المخ.في هذا الصدد ، تجدر الإشارة إلى أن المتصورة المنجلية وفيروس إبشتاين بار يساهمان بشكل تآزري في تكوين سرطان الغدد الليمفاوية في بوركيت.
تم التحقيق على نطاق واسع في دور exosomes كمنظمين في مجال أبحاث السرطان.ومع ذلك ، لا يزال دور exosomes بين الطفيليات والعوائل المصابة غير مفهوم جيدًا.حتى الآن ، أوضحت منظمات مختلفة ، بما في ذلك البروتينات المُفرزة ، العمليات البيولوجية التي تقاوم بها طفيليات الأوالي هجوم العائل وتديم العدوى.في الآونة الأخيرة ، كان هناك مفهوم متنامٍ مفاده أن الحويصلات الدقيقة المرتبطة بالبروتوزوا و microRNAs تتفاعل مع الخلايا المضيفة لخلق بيئة مواتية لبقائهم على قيد الحياة.لذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات لاكتشاف العلاقة بين miRNAs الخارجية المتغيرة وتكاثر خلايا الورم الدبقي.يرتبط تغيير MicroRNA (الجينات العنقودية miR-30c-1 و miR-125b-2 و miR-23b-27b-24-1 و miR-17-92) بمحفز STAT3 في الضامة البشرية المصابة بالتوكسوبلازما ، ويتم تنظيمه ويحث على مكافحة 29- التقرن استجابة لعدوى التوكسوبلازما.تزيد عدوى التوكسوبلازما من التعبير عن miR-17-5p و miR-106b-5p ، المرتبطين بالعديد من أمراض فرط التكاثر 30.تشير هذه البيانات إلى أن miRNAs المضيفة التي تنظمها عدوى التوكسوبلازما هي جزيئات مهمة لبقاء الطفيل وإحداث المرض في السلوك البيولوجي للمضيف.
يمكن أن تؤثر miRNAs المتغيرة على أنواع مختلفة من السلوك أثناء بدء الخلايا الخبيثة وتطورها ، بما في ذلك الأورام الدبقية: الاكتفاء الذاتي لإشارات النمو ، وعدم الحساسية لإشارات تثبيط النمو ، وتجنب موت الخلايا المبرمج ، وإمكانات التكرار غير المحدودة ، وتكوين الأوعية ، والغزو والورم الخبيث ، والالتهاب.في الورم الدبقي ، تم تحديد miRNAs المتغيرة في العديد من دراسات التنميط التعبير.
في هذه الدراسة ، أكدنا وجود مستويات عالية من تعبير miRNA-21 في الخلايا المضيفة المصابة بالتوكسوبلازما.تم تحديد miR-21 كواحد من أكثر جزيئات الحمض النووي الريبي (microRNA) التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط في الأورام الصلبة ، بما في ذلك الأورام الدبقية ، ويرتبط تعبيرها بدرجة الورم الدبقي.تشير الدلائل المتراكمة إلى أن مير -21 هو أحد الجينات الورمية الجديدة التي تعمل كعامل مضاد للاستماتة في نمو الورم الدبقي ويتم التعبير عنه بشكل مفرط في الأنسجة والبلازما لأورام الدماغ البشرية الخبيثة.ومن المثير للاهتمام أن تعطيل miR-21 في خلايا وأنسجة الورم الدبقي يؤدي إلى تثبيط تكاثر الخلايا بسبب موت الخلايا المبرمج المعتمد على كاسباس.كشف تحليل المعلومات الحيوية للأهداف المتنبأ بها miR-21 عن العديد من الجينات المثبطة للورم المرتبطة بمسارات موت الخلايا المبرمج ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج 4 (PDCD4) ، وتروبوميوسين (TPM1) ، و PTEN ، و forkhead box O1 (FoxO1) ، مع موقع ربط miR-2121..22.38.
يشارك FoxO1 ، باعتباره أحد عوامل النسخ (FoxO) ، في تطوير أنواع مختلفة من السرطان البشري ويمكنه تنظيم التعبير عن الجينات المثبطة للورم مثل p21 و p27 و Bim و FasL40.يمكن لـ FoxO1 ربط وتفعيل مثبطات دورة الخلية مثل p27 لقمع نمو الخلايا.علاوة على ذلك ، فإن FoxO1 هو المستجيب الرئيسي لإشارات PI3K / Akt وينظم العديد من العمليات البيولوجية مثل تقدم دورة الخلية وتمايز الخلايا من خلال تنشيط نسخ p2742.
في الختام ، نعتقد أن exosomal miR-21 المشتق من الخلايا الدبقية المكروية المصابة بالتوكسوبلازما قد يلعب دورًا مهمًا كمنظم لنمو خلايا الورم الدبقي (الشكل 7).ومع ذلك ، هناك حاجة إلى مزيد من الدراسات للعثور على صلة مباشرة بين exosomal miR-21 وعدوى التوكسوبلازما المتغيرة ونمو الورم الدبقي.من المتوقع أن توفر هذه النتائج نقطة انطلاق لدراسة العلاقة بين عدوى التوكسوبلازما وحدوث الورم الدبقي.
تم اقتراح رسم تخطيطي لآلية تسرطن الورم الدبقي (الدماغ) في هذه الدراسة.يرسم المؤلف في PowerPoint 2019 (Microsoft ، Redmond ، WA).
كانت جميع البروتوكولات التجريبية في هذه الدراسة ، بما في ذلك استخدام الحيوانات ، متوافقة مع المبادئ التوجيهية الأخلاقية المعيارية للجنة رعاية الحيوان والمستخدمين بجامعة سيول الوطنية وتمت الموافقة عليها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة سيول الوطنية (رقم IRB SNU- 150715).-2).تم تنفيذ جميع الإجراءات التجريبية وفقًا لتوصيات ARRIVE.
تم زرع خلايا الورم الدبقي البشري BV2 و U87 في Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM ؛ Welgene ، سيول ، كوريا) ووسط معهد Roswell Park Memorial (RPMI ؛ Welgene) ، على التوالي ، كل منها يحتوي على 10 ٪ من مصل الأبقار الجنيني ، 4 ملي مولار. الجلوتامين ، 0.2 ملي بنسلين و 0.05 ملي ستربتومايسين.تمت زراعة الخلايا في حاضنة تحتوي على 5٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية.تم استخدام خط خلية ورم دبقي آخر ، U118 ، للمقارنة مع خلايا U87.
لعزل exosomes من سلالتي RH و ME49 المصابة بـ T. gondii ، تم حصاد T. gondii tachyzoites (سلالة RH) من التجويف البطني لفئران BALB / c عمرها 6 أسابيع تم حقنها قبل 3-4 أيام.تم غسل Tachyzoites ثلاث مرات باستخدام PBS وتنقيته بالطرد المركزي في 40 ٪ Percoll (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية).للحصول على tachyzoites من سلالة ME49 ، تم حقن الفئران BALB / ج داخل الصفاق مع 20 كيسًا من الأنسجة وتم جمع تحويل tachyzoite في الخراجات عن طريق غسل تجويف البطن في اليوم السادس إلى الثامن بعد الإصابة (PI).الفئران المصابة ببرنامج تلفزيوني.نمت ME49 tachyzoites في خلايا مكملة بـ 100 ميكروغرام / مل من البنسلين (Gibco / BRL ، جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية) ، 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين (Gibco / BRL) ، و 5 ٪ من مصل الأبقار الجنيني (Lonza ، Walkersville ، MD) .. ، الولايات المتحدة الأمريكية) عند 37 درجة مئوية وثاني أكسيد الكربون بنسبة 5٪.بعد الزراعة في خلايا Vero ، تم تمرير ME49 tachyzoites مرتين من خلال إبرة قياس 25 ثم من خلال مرشح 5 ميكرومتر لإزالة الحطام والخلايا.بعد الغسيل ، تم تعليق tachyzoites في PBS.تم الحفاظ على أكياس الأنسجة من سلالة التوكسوبلازما جوندي ME49 عن طريق الحقن داخل الصفاق من الخراجات المعزولة من دماغ الفئران المصابة C57BL / 6 (مركز أورينت بيو للحيوان ، سيونغنام ، كوريا).تم حصاد أدمغة الفئران المصابة بـ ME49 بعد 3 أشهر من PI وفرمها تحت المجهر لعزل الأكياس.تم الاحتفاظ بالفئران المصابة في ظروف خاصة خالية من مسببات الأمراض (SPF) في كلية الطب بجامعة سيول الوطنية.
تم استخراج إجمالي الحمض النووي الريبي من exosomes وخلايا وأنسجة BV2 المشتقة من BV2 باستخدام مجموعة miRNeasy Mini Kit (Qiagen ، Hilden ، ألمانيا) وفقًا لتعليمات الشركة الصانعة ، بما في ذلك وقت الحضانة لخطوة الشطف.تم تحديد تركيز الحمض النووي الريبي على مقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000.تم تقييم جودة المصفوفات الدقيقة للحمض النووي الريبي باستخدام محلل بيولوجي Agilent 2100 (Agilent Technologies ، أمستلفين ، هولندا).
تم تحضير DMEM مع 10 ٪ من FBS الفقير بالخارج عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100000 جم لمدة 16 ساعة عند 4 درجات مئوية وتم ترشيحها من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر (Nalgene ، روتشستر ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية).تمت زراعة خلايا BV2 ، 5 × 105 ، في DMEM التي تحتوي على 10 ٪ من FBS المستنفد للخارج و 1 ٪ من المضادات الحيوية عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون.بعد 24 ساعة من الحضانة ، تمت إضافة tachyzoites من سلالة RH أو ME49 (MOI = 10) إلى الخلايا وتمت إزالة الطفيليات غير الغازية في غضون ساعة وإعادة ملؤها بـ DMEM.تم عزل Exosomes من خلايا BV2 عن طريق الطرد المركزي التفاضلي المعدل ، وهو الأسلوب الأكثر استخدامًا.أعاده تعليق بيليه exosome في 300 ميكرولتر PBS لتحليل الحمض النووي الريبي أو البروتين.تم تحديد تركيز exosomes المعزولة باستخدام مجموعة فحص بروتين BCA (بيرس ، روكفورد ، IL ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومقياس الطيف الضوئي NanoDrop 2000.
تم تحلل الرواسب من خلايا BV2 أو exosomes المشتقة من BV2 في محلول استخراج البروتين PRO-PREP ™ (iNtRon Biotechnology ، Seongnam ، كوريا) وتم تحميل البروتينات على Coomassie الملون باللون الأزرق اللامع بنسبة 10 ٪ SDS بولي أكريلاميد.بالإضافة إلى ذلك ، تم نقل البروتينات إلى أغشية PVDF لمدة ساعتين.تم التحقق من صحة البقع الغربية باستخدام الجسم المضاد Alix (تقنية تشوير الخلية ، بيفرلي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية) كعلامة خارجية.تم استخدام IgG (H + L) الماعز المضاد للفأر المترافق مع HRP (Bethyl Laboratories ، Montgomery ، TX ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومحلل الصور LAS-1000 plus المضيء (Fuji Photographic Film ، طوكيو ، اليابان) كجسم مضاد ثانوي..تم إجراء الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال لدراسة حجم ومورفولوجيا الإكسوسومات.تم تحضير Exosomes المعزولة من خلايا BV2 (6.40 ميكروغرام / ميكرولتر) على شبكات مغلفة بالكربون وملطخة سلبًا باستخدام 2 ٪ من أسيتات اليورانيل لمدة دقيقة واحدة.لوحظت العينات المحضرة بجهد تسارع 80 كيلو فولت باستخدام JEOL 1200-EX II (طوكيو ، اليابان) مزودة بكاميرا ES1000W Erlangshen CCD (جاتان ، بليزانتون ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية).
تم تلوين exosomes المشتقة من BV2 باستخدام PKH26 Red Fluorescent Linker Kit (Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO ، الولايات المتحدة الأمريكية) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.تم تحضين خلايا U87 ، 2 × 105 ، مع exosomes المسمى PKH26 (أحمر) أو بدون exosomes كعنصر تحكم سلبي ، عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة في حاضنة 5 ٪ CO2.تم تلوين نوى خلية U87 باستخدام DAPI (أزرق) ، وتم إصلاح خلايا U87 في بارافورمالدهيد بنسبة 4 ٪ لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية ثم تحليلها في نظام مجهر متحد البؤر Leica TCS SP8 STED CW (Leica Microsystems ، مانهايم ، ألمانيا).يمكن ملاحظتها.
تم تصنيع (كدنا) من سيرنا باستخدام تخليق خيوط Mir-X siRNA الأولى ومجموعة SYBR qRT-PCR (Takara Bio Inc. ، Shiga ، اليابان).تم إجراء PCR الكمي في الوقت الحقيقي باستخدام نظام الكشف عن تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي iQ5 (Bio-Rad ، Hercules ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام الاشعال والقوالب الممزوجة بـ SYBR Premix.تم تضخيم الحمض النووي لمدة 40 دورة من التمسخ عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية والتصلب عند 60 درجة مئوية لمدة 60 ثانية.تم تحليل البيانات من كل تفاعل PCR باستخدام وحدة تحليل البيانات لبرنامج النظام البصري iQ ™ 5 (Bio-Rad).تم حساب التغييرات النسبية في التعبير الجيني بين الجينات المستهدفة المختارة و β-actin / siRNA (و U6) باستخدام طريقة المنحنى القياسية.يتم عرض تسلسل التمهيدي المستخدم في الجدول 1.
تم زرع 3 × 104 من خلايا الورم الدبقي U87 في 96 طبقًا جيدًا وخلطها مع exosomes المصابة بالتوكسوبلازما المشتقة من BV2 (50 ميكروغرام / مل) أو exosomes غير النبضية المشتقة من BV2 (50 ميكروغرام / مل) كعناصر تحكم في 12 و 18 و 36 ساعة .تم تحديد معدل تكاثر الخلايا باستخدام مجموعة عد الخلايا -8 (دوجيندو ، كوماموتو ، اليابان) (الأشكال التكميلية S1-S3).
تم شراء فئران عارية BALB / c عمرها 5 أسابيع من Orient Bio (Seongnam-si ، كوريا الجنوبية) وتم الاحتفاظ بها بشكل فردي في أقفاص معقمة في درجة حرارة الغرفة (22 ± 2 درجة مئوية) والرطوبة (45 ± 15 درجة مئوية).٪) عند درجة حرارة الغرفة (22 ± 2 درجة مئوية) والرطوبة (45 ± 15٪).تم إجراء دورة ضوئية مدتها 12 ساعة ودورة مظلمة لمدة 12 ساعة تحت SPF (مركز الحيوان التابع لكلية الطب بجامعة سيول الوطنية).تم تقسيم الفئران بشكل عشوائي إلى ثلاث مجموعات من 5 فئران لكل منها وتم حقن جميع المجموعات تحت الجلد بـ 400 مل من PBS تحتوي على 1 × 107 من خلايا الورم الدبقي U87 وعامل النمو يقلل BD Matrigel ™ (BD Science ، ميامي ، فلوريدا ، الولايات المتحدة الأمريكية).بعد ستة أيام من حقن الورم ، تم حقن 200 ملغ من exosomes المشتقة من خلايا BV2 (مع / بدون عدوى التوكسوبلازما) في موقع الورم.بعد اثنين وعشرين يومًا من الإصابة بالورم ، تم قياس حجم الورم في الفئران في كل مجموعة باستخدام الفرجار ثلاث مرات في الأسبوع ، وتم حساب حجم الورم بالصيغة: 0.5 × (عرض) × 2 × طول.
تحليل تعبير MicroRNA باستخدام مصفوفة miRCURYTM LNA miRNA ، يحتوي الجيل السابع على مصفوفات mmu و rno (EXIQON ، Vedbaek ، الدنمارك) تغطي 1119 فأرًا متميزًا جيدًا من بين 3100 من تحقيقات التقاط ميرنا للإنسان والفأر والفئران.خلال هذا الإجراء ، تمت إزالة 250 إلى 1000 نانوغرام من إجمالي الحمض النووي الريبي من 5-فوسفات عن طريق العلاج بالفوسفاتيز القلوي المعوي في ربلة الساق متبوعًا بوضع العلامات باستخدام صبغة الفلورسنت الخضراء Hy3.ثم تم تهجين العينات المسمى عن طريق تحميل شرائح ميكروأري باستخدام مجموعة غرفة التهجين (Agilent Technologies ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية) ومجموعة شرائح التهجين (Agilent Technologies).تم إجراء التهجين لمدة 16 ساعة عند 56 درجة مئوية ، ثم تم غسل المصفوفات الدقيقة وفقًا لتوصيات الشركة الصانعة.تم بعد ذلك مسح شرائح ميكروأري المعالجة باستخدام نظام الماسح الضوئي Agilent G2565CA (Agilent Technologies).تم استيراد الصور الممسوحة ضوئيًا باستخدام إصدار برنامج Agilent Feature Extraction 10.7.3.1 (Agilent Technologies) وتم قياس شدة التألق لكل صورة باستخدام ملف GAL المقابل لبروتوكول Exiqon المعدل.يتم إيداع بيانات Microarray للدراسة الحالية في قاعدة بيانات GEO تحت رقم الانضمام GPL32397.
تم تحليل ملامح التعبير عن miRNAs الخارجية الناضجة في الخلايا الدبقية الصغيرة لسلالات RH أو ME49 المصابة بالتوكسوبلازما باستخدام أدوات الشبكة المختلفة.تم تحديد miRNAs المرتبطة بتطور الورم باستخدام miRWalk2.0 (//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de) وتم تصفيتها باستخدام كثافة إشارة طبيعية (log2) أكبر من 8.0.من بين miRNAs ، تم العثور على miRNAs المعبر عنها تفاضليًا أكثر من 1.5 ضعفًا تم تغييرها عن طريق تحليل مرشح miRNAs التي تم تغييرها بواسطة سلالات RH أو ME49 المصابة بـ T. gondii.
تم زرع الخلايا في ستة أطباق (3 × 105 خلية / بئر) في opti-MEM (Gibco ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية) باستخدام Lipofectamine 2000 (Invitrogen ، Carlsbad ، CA ، الولايات المتحدة الأمريكية).زرعت الخلايا المصابة بالعدوى المنقولة لمدة 6 ساعات ثم تم تغيير الوسط إلى وسط كامل جديد.تم حصاد الخلايا بعد 24 ساعة من تعداء.
تم إجراء التحليل الإحصائي بشكل أساسي باستخدام اختبار الطالب مع برنامج Excel (Microsoft ، واشنطن العاصمة ، الولايات المتحدة الأمريكية).لتحليل الحيوانات التجريبية ، تم إجراء ANOVA ثنائي الاتجاه باستخدام برنامج Prism 3.0 (برنامج GraphPad ، لا جولا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية). اعتبرت قيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية. اعتبرت قيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية. ترجمة P <0،05 ساعة عمل. اعتبرت قيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية. ف 值 <0.05 被 认为 具有 统计学 意义。 ف 值 <0.05 ترجمة P <0،05 ساعة عمل. اعتبرت قيم P <0.05 ذات دلالة إحصائية.
تمت الموافقة على جميع البروتوكولات التجريبية المستخدمة في هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة سيول الوطنية (رقم IRB SNU-150715-2).
The data used in this study are available upon reasonable request from the first author (BK Jung; mulddang@snu.ac.kr). And the microarray data for the current study is deposited in the GEO database under registration number GPL32397.
فورلي ، ج. وآخرون.تقديرات معدلات الإصابة بالسرطان والوفيات العالمية لعام 2018: مصادر وطرق GLOBOCAN.ترجمة.جيه روك 144 ، 1941-1953 (2019).
رشيد ، س. ، رحمن ، ك. وأكاش ، MS نظرة ثاقبة لعوامل الخطر لأورام الدماغ والتدخلات العلاجية. رشيد ، س. ، رحمن ، ك. وأكاش ، MS نظرة ثاقبة لعوامل الخطر لأورام الدماغ والتدخلات العلاجية.راشد ، س ، رحمن ، ك. وأكاش ، MS مراجعة لعوامل الخطر لأورام المخ والتدخلات العلاجية الرئيسية. رشيد ، س. ، رحمن ، ك. & أكاش ، MS 深入 了解 脑 肿瘤 的 危险 因素 及其 治疗 干预 措施。 رشيد ، س. ، رحمن ، ك. وأكاش ، MS فهم عميق لعوامل خطر الإصابة بأورام المخ والتدخلات العلاجية.راشد ، س ، رحمن ، ك. وأكاش ، MS مراجعة لعوامل الخطر لأورام المخ والتدخلات العلاجية الرئيسية.علم الطب الحيوي.صيدلاني.143 ، 112119 (2021).
Kato، I.، Zhang، J. & Sun، J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطان الجهاز الهضمي البشري وسرطان الجهاز التناسلي للأنثى: ملخص للأدلة الوبائية والمختبرية. Kato، I.، Zhang، J. & Sun، J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطان الجهاز الهضمي البشري وسرطان الجهاز التناسلي للأنثى: ملخص للأدلة الوبائية والمختبرية.Kato I. و Zhang J. و Sun J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطان الجهاز الهضمي البشري والجهاز التناسلي الأنثوي: ملخص للبيانات الوبائية والمختبرية. كاتو ، آي ، تشانغ ، جي آند صن ، جي. 人类 口腔 消化道 癌 和 女性 生殖 道 癌 中 的 细菌 - 病毒 相互作用 ： 流行病学 和 实验室 证据 总结。 Kato، I.، Zhang، J. & Sun، J. Bacterio-viral Interaction in human mouth and female tract القناة التناسلية: ملخص لعلم الأمراض الشعبية والأدلة المختبرية.Kato I. و Zhang J. و Sun J. التفاعلات البكتيرية الفيروسية في سرطان الجهاز الهضمي البشري وسرطان الأعضاء التناسلية الأنثوية: ملخص للبيانات الوبائية والمختبرية.السرطان 14 ، 425 (2022).
Magon، KL & Parish، JL من العدوى إلى السرطان: كيف تغير فيروسات ورم الحمض النووي في الخلية المضيفة استقلاب الكربون والدهون المركزي. Magon، KL & Parish، JL من العدوى إلى السرطان: كيف تغير فيروسات ورم الحمض النووي في الخلية المضيفة استقلاب الكربون والدهون المركزي.Mahon ، KL and Parish ، JL عدوى السرطان: كيف تغير فيروسات الورم القائمة على الحمض النووي الخلية المضيفة استقلاب الكربون والدهون المركزي. Magon، KL & Parish، JL 从 感染 到 癌症 ： DNA 肿瘤 病毒 如何 改变 宿主 细胞 的 中心 碳 和 脂质 代谢。 Magon، KL & Parish، JL من العدوى إلى السرطان: كيف تغير فيروسات ورم الحمض النووي الخلية المضيفة استقلاب الكربون والدهون المركزي.Mahon، KL and Parish، JL تؤدي إلى الإصابة بالسرطان: كيف تغير فيروسات ورم الحمض النووي عملية التمثيل الغذائي للكربون والدهون المركزية في الخلايا المضيفة.فتح علم الأحياء.11 ، 210004 (2021).
كوريا دا كوستا ، جي إم وآخرون.استروجين الكاتيكول من المنشقات ومثقوب الكبد والسرطان المرتبط بالديدان الطفيلية.أمامي.حار من الداخل.5 ، 444 (2014).