شكرًا لك على زيارة Nature.com.إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS.للحصول على أفضل تجربة ، نوصي باستخدام مستعرض محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer).في غضون ذلك ، لضمان استمرار الدعم ، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
يجب أن تكون النواقل الجينية لعلاج التليف الكيسي الرئوي موجهة إلى المسالك الهوائية الموصلة ، نظرًا لأن نقل الرئة المحيطي ليس له أي تأثير علاجي.ترتبط كفاءة النقل الفيروسي ارتباطًا مباشرًا بوقت مكوث الناقل.ومع ذلك ، فإن سوائل التوصيل مثل ناقلات الجينات تنتشر بشكل طبيعي في الحويصلات الهوائية أثناء الاستنشاق ، ويتم إزالة الجسيمات العلاجية من أي شكل بسرعة عن طريق النقل المخاطي الهدبي.إن تمديد فترة بقاء ناقلات الجينات في الجهاز التنفسي أمر مهم ولكن من الصعب تحقيقه.يمكن للجسيمات المغناطيسية المقترنة بالحامل والتي يمكن توجيهها إلى سطح الجهاز التنفسي تحسين الاستهداف الإقليمي.بسبب مشاكل التصوير في الجسم الحي ، فإن سلوك هذه الجسيمات المغناطيسية الصغيرة على سطح مجرى الهواء في وجود مجال مغناطيسي مطبق غير مفهوم جيدًا.كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام التصوير السنكروتروني لتصور في الجسم الحي حركة سلسلة من الجسيمات المغناطيسية في القصبة الهوائية للفئران المخدرة من أجل دراسة ديناميكيات وأنماط سلوك الجسيمات المفردة والكتلة في الجسم الحي.ثم قمنا أيضًا بتقييم ما إذا كان توصيل الجسيمات المغناطيسية للفيروسات البطيئة في وجود مجال مغناطيسي سيزيد من كفاءة التحويل في القصبة الهوائية للجرذان.يُظهر التصوير بالأشعة السينية السنكروترون سلوك الجسيمات المغناطيسية في الحقول المغناطيسية الثابتة والمتحركة في المختبر وفي الجسم الحي.لا يمكن سحب الجسيمات بسهولة عبر سطح المسالك الهوائية الحية باستخدام المغناطيس ، ولكن أثناء النقل ، تتركز الرواسب في مجال الرؤية ، حيث يكون المجال المغناطيسي أقوى.تمت زيادة كفاءة النقل ستة أضعاف عندما تم تسليم الجسيمات المغناطيسية للفيروسات البطيئة في وجود مجال مغناطيسي.مجتمعة ، تشير هذه النتائج إلى أن الجسيمات المغناطيسية للفيروسات البطيئة والمجالات المغناطيسية قد تكون طرقًا قيمة لتحسين استهداف ناقلات الجينات ومستويات النقل في المسالك الهوائية الموصلة في الجسم الحي.
يحدث التليف الكيسي (CF) بسبب الاختلافات في جين واحد يسمى منظم توصيل الغشاء CFTR (CFTR).بروتين CFTR هو قناة أيونية موجودة في العديد من الخلايا الظهارية في جميع أنحاء الجسم ، بما في ذلك الشعب الهوائية ، وهي موقع رئيسي في التسبب في التليف الكيسي.تؤدي عيوب CFTR إلى نقل غير طبيعي للمياه ، وجفاف سطح مجرى الهواء ، وانخفاض عمق طبقة السوائل في مجرى الهواء (ASL).كما أنه يضعف قدرة نظام النقل المخاطي الهدبي (MCT) على تطهير الممرات الهوائية من الجزيئات المستنشقة ومسببات الأمراض.هدفنا هو تطوير العلاج الجيني للفيروسات البطيئة (LV) لتقديم النسخة الصحيحة من جين CFTR وتحسين ASL و MCT وصحة الرئة ، ومواصلة تطوير تقنيات جديدة يمكنها قياس هذه المعلمات في الجسم الحي 1.
نواقل LV هي واحدة من المرشحين الرئيسيين للعلاج الجيني للتليف الكيسي ، ويرجع ذلك أساسًا إلى قدرتها على دمج الجين العلاجي بشكل دائم في الخلايا القاعدية لمجرى الهواء (الخلايا الجذعية للمجرى الهوائي).هذا مهم لأنه يمكنهم استعادة الترطيب الطبيعي وإزالة المخاط عن طريق التمايز إلى خلايا وظيفية لسطح مجرى الهواء مصححة جينيًا مرتبطة بالتليف الكيسي ، مما يؤدي إلى فوائد تستمر مدى الحياة.يجب توجيه نواقل LV ضد المسالك الهوائية الموصلة ، حيث تبدأ مشاركة الرئة في التليف الكيسي.قد يؤدي توصيل الناقل إلى عمق الرئة إلى نقل السنخية ، ولكن هذا ليس له تأثير علاجي في التليف الكيسي.ومع ذلك ، فإن السوائل مثل ناقلات الجينات تهاجر بشكل طبيعي إلى الحويصلات الهوائية عند استنشاقها بعد الولادة ، ويتم طرد الجزيئات العلاجية بسرعة في تجويف الفم بواسطة MCTs.ترتبط كفاءة توصيل الجهد المنخفض ارتباطًا مباشرًا بطول الوقت الذي يظل فيه الناقل قريبًا من الخلايا المستهدفة للسماح بالامتصاص الخلوي - "وقت الإقامة" 5 الذي يتم تقصيره بسهولة عن طريق تدفق الهواء الإقليمي النموذجي وكذلك الامتصاص المنسق للمخاط وجزيئات MCT.بالنسبة للتليف الكيسي ، فإن القدرة على إطالة وقت مكوث الجهد المنخفض في المسالك الهوائية مهمة لتحقيق مستويات عالية من التنبيغ في هذه المنطقة ، ولكنها كانت تمثل تحديًا حتى الآن.
للتغلب على هذه العقبة ، نقترح أن الجسيمات المغناطيسية ذات الجهد المنخفض (MPs) يمكن أن تساعد بطريقتين متكاملتين.أولاً ، يمكن توجيهها بواسطة مغناطيس إلى سطح مجرى الهواء لتحسين الاستهداف ومساعدة الجينات الحاملة للجينات على التواجد في المنطقة الصحيحة من مجرى الهواء ؛و ASL) إلى طبقة الخلية 6. تُستخدم MPs على نطاق واسع كوسيلة لتوصيل الأدوية المستهدفة عندما ترتبط بالأجسام المضادة أو أدوية العلاج الكيميائي أو الجزيئات الصغيرة الأخرى التي ترتبط بأغشية الخلايا أو ترتبط بمستقبلات سطح الخلية الخاصة بها وتتراكم في مواقع الورم في وجود الكهرباء الساكنة.المجالات المغناطيسية لعلاج السرطان 7. تهدف الطرق الأخرى "شديدة الحرارة" إلى قتل الخلايا السرطانية عن طريق تسخين أعضاء البرلمان عند تعرضهم لمجالات مغناطيسية متذبذبة.يُستخدَم مبدأ تعداء العدوى المغناطيسي ، حيث يُستخدم المجال المغناطيسي كعامل تعداء لتعزيز نقل الحمض النووي إلى الخلايا ، بشكل شائع في المختبر باستخدام مجموعة من نواقل الجينات غير الفيروسية والفيروسية لخطوط الخلايا التي يصعب تحويلها ..تم إنشاء كفاءة النقل المغناطيسي LV مع توصيل LV MP في المختبر إلى خط خلية من ظهارة الشعب الهوائية البشرية في وجود مجال مغناطيسي ثابت ، مما أدى إلى زيادة كفاءة النقل بمقدار 186 مرة مقارنة مع متجه LV وحده.تم تطبيق LV MT أيضًا على نموذج في المختبر من التليف الكيسي ، حيث زاد النقل المغناطيسي من انتقال LV في ثقافات واجهة الهواء والسائل بعامل 20 في وجود بلغم التليف الكيسي.ومع ذلك ، تلقى النقل المغناطيسي للأعضاء في الجسم الحي القليل من الاهتمام نسبيًا ولم يتم تقييمه إلا في عدد قليل من الدراسات على الحيوانات ، وخاصة في الرئتين.ومع ذلك ، فإن احتمالات تعداء الخلايا المغناطيسية في علاج الرئة في التليف الكيسي واضحة.تان وآخرون.ذكر (2020) أن "دراسة التحقق من التوصيل الرئوي الفعال للجسيمات النانوية المغناطيسية ستمهد الطريق لاستراتيجيات استنشاق CFTR المستقبلية لتحسين النتائج السريرية لدى مرضى التليف الكيسي" 6.
يصعب تصور ودراسة سلوك الجزيئات المغناطيسية الصغيرة على سطح الجهاز التنفسي في وجود مجال مغناطيسي مطبق ، وبالتالي فهي غير مفهومة جيدًا.في دراسات أخرى ، قمنا بتطوير طريقة التصوير بالأشعة السينية على النقيض من انتشار السنكروترون (PB-PCXI) للتصوير غير الغازي والتقدير الكمي للتغيرات الدقيقة في الجسم الحي في عمق ASL18 وسلوك MCT19 ، 20 لقياس ترطيب سطح قناة الغاز مباشرة ويستخدم كمؤشر مبكر لفعالية العلاج.بالإضافة إلى ذلك ، تستخدم طريقة تسجيل MCT الخاصة بنا جزيئات قطرها 10-35 ميكرومتر مكونة من الألومينا أو زجاج معامل الانكسار العالي كعلامات MCT مرئية باستخدام PB-PCXI21.كلتا الطريقتين مناسبتان لتصوير مجموعة من أنواع الجسيمات ، بما في ذلك أعضاء البرلمان.
نظرًا للدقة المكانية والزمانية العالية ، فإن فحوصات ASL و MCT المستندة إلى PB-PCXI مناسبة تمامًا لدراسة الديناميات والأنماط السلوكية للجسيمات المفردة والسائبة في الجسم الحي لمساعدتنا على فهم وتحسين طرق توصيل الجينات MP.يعتمد النهج الذي نستخدمه هنا على دراساتنا باستخدام خط الأشعة SPring-8 BL20B2 ، حيث تصورنا حركة السوائل بعد توصيل جرعة من ناقل وهمي إلى المجاري الهوائية الأنفية والرئوية للفئران للمساعدة في شرح أنماط التعبير الجيني غير المتجانسة التي لوحظت في جيناتنا.الدراسات على الحيوانات بجرعة حاملة 3.4.
كان الهدف من هذه الدراسة هو استخدام السنكروترون PB-PCXI لتصور الحركات في الجسم الحي لسلسلة من أعضاء البرلمان في القصبة الهوائية للجرذان الحية.تم تصميم دراسات التصوير PB-PCXI هذه لاختبار سلسلة MP وقوة المجال المغناطيسي والموقع لتحديد تأثيرها على حركة MP.افترضنا أن المجال المغناطيسي الخارجي سيساعد MF الذي تم تسليمه على البقاء أو الانتقال إلى المنطقة المستهدفة.سمحت لنا هذه الدراسات أيضًا بتحديد تكوينات المغناطيس التي تزيد من كمية الجزيئات المتبقية في القصبة الهوائية بعد الترسب.في سلسلة ثانية من الدراسات ، كنا نهدف إلى استخدام هذا التكوين الأمثل لإثبات نمط التحويل الناتج عن التسليم في الجسم الحي لـ LV-MPs إلى المجاري الهوائية للفئران ، على افتراض أن تسليم LV-MPs في سياق استهداف مجرى الهواء سينتج في زيادة كفاءة توصيل الجهد المنخفض..
أجريت جميع الدراسات على الحيوانات وفقًا للبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة أديلايد (M-2019-060 و M-2020-022) ولجنة الأخلاقيات الحيوانية SPring-8 Synchrotron.أجريت التجارب وفقًا لتوصيات ARRIVE.
تم التقاط جميع صور الأشعة السينية في خط الحزمة BL20XU في السنكروترون SPring-8 في اليابان باستخدام إعداد مشابه لما تم وصفه سابقًا.باختصار ، كان الصندوق التجريبي يقع على بعد 245 مترًا من حلقة تخزين السنكروترون.تُستخدم مسافة العينة إلى الكاشف 0.6 متر لدراسات تصوير الجسيمات و 0.3 متر لدراسات التصوير في الجسم الحي لإنشاء تأثيرات تباين الطور.تم استخدام شعاع أحادي اللون بطاقة 25 كيلو فولت.تم الحصول على الصور باستخدام محول الأشعة السينية عالي الدقة (SPring-8 BM3) إلى جانب كاشف sCMOS.يحول محول الطاقة الأشعة السينية إلى ضوء مرئي باستخدام وميض بسمك 10 ميكرومتر (Gd3Al2Ga3O12) ، والذي يتم توجيهه بعد ذلك إلى مستشعر sCMOS باستخدام هدف مجهر × 10 (NA 0.3).كان كاشف sCMOS عبارة عن Orca-Flash 4.0 (Hamamatsu Photonics ، اليابان) بحجم مصفوفة 2048 × 2048 بكسل وحجم بكسل خام يبلغ 6.5 × 6.5 ميكرومتر.يعطي هذا الإعداد حجم بكسل متناحٍ فعال يبلغ 0.51 ميكرومتر ومجال رؤية يبلغ حوالي 1.1 مم × 1.1 مم.تم اختيار مدة التعرض البالغة 100 مللي ثانية لتعظيم نسبة الإشارة إلى الضوضاء للجسيمات المغناطيسية داخل وخارج الممرات الهوائية مع تقليل آثار الحركة الناتجة عن التنفس.بالنسبة للدراسات في الجسم الحي ، تم وضع مصراع سريع للأشعة السينية في مسار الأشعة السينية للحد من جرعة الإشعاع عن طريق منع حزمة الأشعة السينية بين حالات التعرض.
لم يتم استخدام وسائط LV في أي دراسات تصوير SPring-8 PB-PCXI لأن غرفة التصوير BL20XU ليست معتمدة من المستوى 2 من السلامة الحيوية.بدلاً من ذلك ، اخترنا مجموعة من النواب المتميزين جيدًا من بائعين تجاريين يغطيان مجموعة من الأحجام والمواد وتركيزات الحديد والتطبيقات - أولاً لفهم كيفية تأثير المجالات المغناطيسية على حركة أعضاء البرلمان في الشعيرات الدموية الزجاجية ، ثم في المسالك الهوائية الحية.سطح - المظهر الخارجي.يختلف حجم MP من 0.25 إلى 18 ميكرومتر وهو مصنوع من مواد مختلفة (انظر الجدول 1) ، لكن تكوين كل عينة ، بما في ذلك حجم الجسيمات المغناطيسية في MP ، غير معروف.استنادًا إلى دراساتنا المكثفة MCT 19 ، 20 ، 21 ، 23 ، 24 ، نتوقع أنه يمكن رؤية أعضاء البرلمان حتى 5 ميكرومتر على سطح مجرى الهواء الرغامي ، على سبيل المثال ، عن طريق طرح إطارات متتالية لرؤية تحسين الرؤية لحركة MP.تعد MP واحدة تبلغ 0.25 ميكرومتر أصغر من دقة جهاز التصوير ، ولكن من المتوقع أن يكتشف PB-PCXI تباينها الحجمي وحركة السائل السطحي الذي يتم ترسيبها عليه بعد ترسيبها.
عينات لكل MP في الجدول.تم تحضير 1 في 20 ميكرولتر من الشعيرات الدموية الزجاجية (Drummond Microcaps ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية) بقطر داخلي يبلغ 0.63 ملم.الجسيمات العضلية متوفرة في الماء ، بينما جزيئات CombiMag متوفرة في السائل الخاص بالشركة المصنعة.كل أنبوب نصف مليء بالسائل (حوالي 11 ميكرولتر) ويوضع على حامل العينة (انظر الشكل 1).تم وضع الشعيرات الدموية الزجاجية أفقيًا على المسرح في غرفة التصوير ، على التوالي ، وتم وضعها عند حواف السائل.تم إرفاق مغناطيس نيكل بقطر 19 مم (بطول 28 مم) مصنوع من الأرض النادرة والنيوديميوم والحديد والبورون (NdFeB) (N35 ، القط رقم LM1652 ، Jaycar Electronics ، أستراليا) بقايا 1.17 T جدول نقل منفصل لتحقيق تغيير موضعك عن بعد أثناء التقديم.يبدأ التصوير بالأشعة السينية عندما يتم وضع المغناطيس فوق العينة بحوالي 30 مم ويتم الحصول على الصور بمعدل 4 إطارات في الثانية.أثناء التصوير ، تم تقريب المغناطيس من الأنبوب الشعري الزجاجي (على مسافة حوالي 1 مم) ثم تحرك على طول الأنبوب لتقييم تأثير شدة المجال والموقع.
إعداد تصوير في المختبر يحتوي على عينات MP في الشعيرات الدموية الزجاجية في مرحلة ترجمة العينة xy.يتم تمييز مسار شعاع الأشعة السينية بخط أحمر منقط.
بمجرد تحديد رؤية أعضاء البرلمان في المختبر ، تم اختبار مجموعة فرعية منهم في الجسم الحي على فئران من النوع البري من فئران Wistar البيضاء (حوالي 12 أسبوعًا ، حوالي 200 جم).Medetomidine 0.24 مجم / كجم (Domitor® ، Zenoaq ، اليابان) ، الميدازولام 3.2 مجم / كجم (Dormicum® ، Astellas Pharma ، اليابان) و butorphanol 4 مجم / كجم (Vetorphale® ، Meiji Seika).تم تخدير الفئران بخليط فارما (اليابان) عن طريق الحقن داخل الصفاق.بعد التخدير ، تم تحضيرهم للتصوير عن طريق إزالة الفراء حول القصبة الهوائية ، وإدخال أنبوب داخل القصبة الهوائية (ET ؛ 16 Ga في الوريد قنية ، Terumo BCT) ، وتثبيتها في وضع ضعيف على لوحة تصوير مصنوعة خصيصًا تحتوي على كيس حراري للحفاظ على درجة حرارة الجسم.22. ثم تم إرفاق لوحة التصوير بمرحلة العينة في صندوق التصوير بزاوية طفيفة لمحاذاة القصبة الهوائية أفقيًا على صورة الأشعة السينية كما هو موضح في الشكل 2 أ.
(أ) في إعداد التصوير الحي في وحدة التصوير SPring-8 ، مسار شعاع الأشعة السينية مميز بخط أحمر منقط.(ب ، ج) تم إجراء توطين مغناطيس القصبة الهوائية عن بعد باستخدام كاميرتين IP مثبتتين بشكل متعامد.على الجانب الأيسر من الصورة على الشاشة ، يمكنك رؤية الحلقة السلكية التي تمسك الرأس وقنية التوصيل المثبتة داخل أنبوب ET.
تم توصيل نظام مضخة حقنة يتم التحكم فيها عن بعد (UMP2 ، World Precision Instruments ، Sarasota ، FL) باستخدام حقنة زجاجية 100 ميكرولتر بأنابيب PE10 (0.61 مم OD ، 0.28 مم معرف) باستخدام إبرة 30 Ga.ضع علامة على الأنبوب للتأكد من أن الطرف في الموضع الصحيح في القصبة الهوائية عند إدخال الأنبوب الرغامي.باستخدام مضخة صغيرة ، تمت إزالة مكبس المحاقن وغمر طرف الأنبوب في عينة MP ليتم تسليمها.ثم تم إدخال أنبوب التسليم المحمل في الأنبوب الرغامي ، ووضع الطرف في أقوى جزء من المجال المغناطيسي المطبق المتوقع.تم التحكم في الحصول على الصورة باستخدام كاشف التنفس المتصل بصندوق التوقيت القائم على Arduino ، وتم تسجيل جميع الإشارات (على سبيل المثال ، درجة الحرارة ، والتنفس ، وفتح / إغلاق الغالق ، والحصول على الصورة) باستخدام Powerlab و LabChart (AD Instruments ، سيدني ، أستراليا) 22 عند التصوير عندما لا يتوفر السكن ، تم وضع كاميرتين IP (Panasonic BB-SC382) عند 90 درجة تقريبًا لبعضهما البعض واستخدامهما للتحكم في موضع المغناطيس بالنسبة للقصبة الهوائية أثناء التصوير (الشكل 2 ب ، ج).لتقليل آثار الحركة ، تم الحصول على صورة واحدة لكل نفس أثناء هضبة تدفق الجهاز التنفسي.
يتم توصيل المغناطيس بالمرحلة الثانية ، والتي قد تكون موجودة عن بُعد على الجزء الخارجي من جسم التصوير.تم اختبار أوضاع وتشكيلات مختلفة للمغناطيس ، بما في ذلك: وضعها بزاوية تبلغ حوالي 30 درجة فوق القصبة الهوائية (تظهر التكوينات في الشكلين 2 أ و 3 أ) ؛مغناطيس واحد فوق الحيوان والآخر أدناه ، مع وضع القطبين للجذب (الشكل 3 ب).، مغناطيس واحد فوق الحيوان وآخر أدناه ، مع وضع القطبين للتنافر (الشكل 3 ج) ، ومغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية وعموديه (الشكل 3 د).بعد إعداد الحيوان والمغناطيس وتحميل MP قيد الاختبار في مضخة الحقن ، قم بإيصال جرعة مقدارها 50 ميكرولتر بمعدل 4 ميكرولتر / ثانية عند الحصول على الصور.ثم يتم تحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا على طول القصبة الهوائية أو عبرها مع الاستمرار في التقاط الصور.
تكوين مغناطيسي للتصوير في الجسم الحي (أ) مغناطيس واحد فوق القصبة الهوائية بزاوية 30 درجة تقريبًا ، (ب) مغناطيسان تم تكوينهما للجذب ، (ج) مغناطيسان تم تكوينهما للتنافر ، (د) مغناطيس واحد أعلى وعمودي على ةقصبة الهوائية.نظر المراقب من الفم إلى الرئتين من خلال القصبة الهوائية وتمر شعاع الأشعة السينية عبر الجانب الأيسر للفأر وخرجت من الجانب الأيمن.يتم تحريك المغناطيس على طول مجرى الهواء أو اليسار واليمين فوق القصبة الهوائية في اتجاه حزمة الأشعة السينية.
كما سعينا إلى تحديد مدى وضوح وسلوك الجزيئات في الشعب الهوائية في حالة عدم اختلاط التنفس ومعدل ضربات القلب.لذلك ، في نهاية فترة التصوير ، تم قتل الحيوانات بطريقة إنسانية بسبب جرعة زائدة من البنتوباربيتال (Somnopentyl ، Pitman-Moore ، Washington Crossing ، الولايات المتحدة الأمريكية ؛ ~ 65 مجم / كجم في IP).تركت بعض الحيوانات على منصة التصوير ، وبعد توقف التنفس وضربات القلب ، تكررت عملية التصوير ، مع إضافة جرعة إضافية من MP في حالة عدم ظهور MP على سطح مجرى الهواء.
تم تصحيح الصور الناتجة لحقل مسطح ومظلم ثم تم تجميعها في فيلم (20 إطارًا في الثانية ؛ 15-25 × السرعة العادية اعتمادًا على معدل التنفس) باستخدام نص مخصص مكتوب بلغة MATLAB (R2020a ، The Mathworks).
أجريت جميع الدراسات حول توصيل ناقلات الجينات LV في مركز أبحاث الحيوانات في مختبر جامعة أديلايد وتهدف إلى استخدام نتائج تجربة SPring-8 لتقييم ما إذا كان تسليم LV-MP في وجود مجال مغناطيسي يمكن أن يعزز نقل الجينات في الجسم الحي .لتقييم تأثيرات MF والمجال المغناطيسي ، عولجت مجموعتان من الحيوانات: مجموعة واحدة تم حقنها باستخدام LV MF مع وضع مغناطيسي ، والمجموعة الأخرى تم حقنها بمجموعة تحكم باستخدام LV MF بدون مغناطيس.
تم إنشاء نواقل الجين LV باستخدام الطرق الموصوفة سابقًا 25 ، 26.يعبر ناقل LacZ عن جين بيتا جالاكتوزيداز موضعي نوويًا مدفوعًا بمحفز MPSV التأسيسي (LV-LacZ) ، والذي ينتج منتج تفاعل أزرق في الخلايا المنقولة ، المرئي على الجبهات وأقسام أنسجة الرئة.تم إجراء المعايرة في مزارع الخلايا عن طريق حساب عدد الخلايا الإيجابية لـ LacZ يدويًا باستخدام مقياس الهيموسيتومتر لحساب العيار بوحدة TU / ml.يتم حفظ الناقلات بالتبريد في درجة حرارة -80 درجة مئوية ، ويتم إذابتها قبل الاستخدام ، ويتم ربطها بـ CombiMag عن طريق خلط 1: 1 والاحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل قبل التسليم.
جرذان Sprague Dawley العادي (ن = 3 / مجموعة ، ~ 2-3 IP مخدر بمزيج من 0.4 مجم / كجم ميديتوميدين (Domitor ، إليوم ، أستراليا) و 60 مجم / كجم كيتامين (إليوم ، أستراليا) عند عمر شهر واحد) IP ) الحقن وإدخال إدخال القنية عن طريق الفم غير الجراحي باستخدام قنية في الوريد 16 Ga.للتأكد من أن أنسجة مجرى الهواء الرغامي تستقبل نقل الجهد المنخفض ، تم تكييفها باستخدام بروتوكول الاضطرابات الميكانيكية الموصوف سابقًا والذي تم فيه فرك سطح مجرى الهواء الرغامي محوريًا بسلة سلكية (مستخرج حجر النيتينول N-Circle بدون طرف NTSE-022115) -UDH ، Cook Medical ، الولايات المتحدة الأمريكية) 30 ص 28.بعد ذلك ، بعد حوالي 10 دقائق من الاضطراب في خزانة السلامة الأحيائية ، تم إجراء إدارة القصبة الهوائية لـ LV-MP.
تم تكوين المجال المغناطيسي المستخدم في هذه التجربة بشكل مشابه لدراسة الأشعة السينية في الجسم الحي ، مع نفس المغناطيسات الموجودة فوق القصبة الهوائية مع مشابك دعامة التقطير (الشكل 4).تم تسليم حجم 50 ميكرولتر (2 × 25 ميكرولتر) من LV-MP إلى القصبة الهوائية (ن = 3 حيوانات) باستخدام ماصة ذات رأس هلامي كما هو موضح سابقًا.تلقت المجموعة الضابطة (ن = 3 حيوانات) نفس LV-MP دون استخدام مغناطيس.بعد الانتهاء من التسريب ، تتم إزالة القنية من الأنبوب الرغامي ويتم نزع الأنبوب من الحيوان.يظل المغناطيس في مكانه لمدة 10 دقائق قبل إزالته.تم حقن الجرذان تحت الجلد بميلوكسيكام (1 مل / كجم) (إليوم ، أستراليا) متبوعًا بسحب التخدير عن طريق الحقن داخل الصفاق بمقدار 1 مجم / كجم من هيدروكلوريد الأتيبامازول (Antisedan ، Zoetis ، أستراليا).تم إبقاء الفئران دافئة ومراقبتها حتى الشفاء التام من التخدير.
جهاز توصيل LV-MP في خزانة أمان بيولوجي.يمكنك أن ترى أن غلاف Luer-lock ذي اللون الرمادي الفاتح لأنبوب ET يبرز من الفم ، ويتم إدخال طرف ماصة الهلام الموضح في الشكل عبر أنبوب ET إلى العمق المطلوب في القصبة الهوائية.
بعد أسبوع واحد من إجراء إدارة LV-MP ، تم التضحية بالحيوانات بطريقة إنسانية عن طريق استنشاق 100 ٪ من ثاني أكسيد الكربون وتم تقييم تعبير LacZ باستخدام علاج X-gal القياسي.تمت إزالة الحلقات الثلاث الأكثر ذيلية من الغضاريف الذيلية للتأكد من أن أي ضرر ميكانيكي أو احتباس السوائل بسبب وضع الأنبوب الرغامي لن يتم تضمينه في التحليل.تم قطع كل القصبة الهوائية بالطول للحصول على نصفين للتحليل ووضعهما في كوب يحتوي على مطاط السيليكون (Sylgard ، Dow Inc) باستخدام إبرة Minutien (Fine Science Tools) لتصور السطح اللمعي.تم تأكيد توزيع وخصائص الخلايا المنقولة عن طريق التصوير الأمامي باستخدام مجهر نيكون (SMZ1500) مع كاميرا DigiLite وبرنامج TCapture (Tucsen Photonics ، الصين).تم الحصول على الصور بتكبير 20x (بما في ذلك الحد الأقصى للإعداد للعرض الكامل للقصبة الهوائية) ، مع عرض كامل طول القصبة الهوائية خطوة بخطوة ، مما يوفر تداخلًا كافيًا بين كل صورة للسماح بـ "خياطة" الصور.تم بعد ذلك دمج الصور من كل القصبة الهوائية في صورة مركبة واحدة باستخدام الإصدار 2.0.3 من محرر الصور المركب (Microsoft Research) باستخدام خوارزمية الحركة المستوية. تم قياس مساحة تعبير LacZ داخل الصور المركبة للقصبة الهوائية من كل حيوان باستخدام برنامج نصي MATLAB آلي (R2020a ، MathWorks) كما هو موضح سابقًا ، باستخدام إعدادات 0.35 <Hue <0.58 ، والتشبع> 0.15 ، والقيمة <0.7. تم قياس مساحة تعبير LacZ داخل الصور المركبة للقصبة الهوائية من كل حيوان باستخدام برنامج نصي MATLAB آلي (R2020a ، MathWorks) كما هو موضح سابقًا ، باستخدام إعدادات 0.35 <Hue <0.58 ، والتشبع> 0.15 ، والقيمة <0.7. Площадь экспрессии LacZ в составных изображениях трахеи от каждого животного была количественно определена с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее28, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0 ، 7. تم قياس مساحة تعبير LacZ في صور القصبة الهوائية المركبة من كل حيوان باستخدام برنامج نصي MATLAB آلي (R2020a ، MathWorks) كما هو موضح سابقًا باستخدام إعدادات 0.350.15 وقيمة <0 .7.如前所述 ， 使用 自动 MATLAB 脚本 （R2020a ， MathWorks） 对 来自 每只 动物 的 气管 复合 图像 中 LacZ 表达 区域 进行 量化 ， 0.35 <色调 <0.58 、 饱和 度> 0.15 和 值 <0.7 的 设置。如 前所 述 ， 自动 自动 ماتلاب 脚本 （（r2020a ， ماثووركس） 来自 每 只 的 气管 复合 的 的 的 的 表达 使用 0.35 <色调 <0.58 、> 0.15 和 值 <0.7 的 。。。。。 .................... خاصرة Области экспрессии LacZ на составных изображениях трахеи каждого животного количественно определяли с использованием автоматизированного сценария MATLAB (R2020a, MathWorks), как описано ранее, с использованием настроек 0,35 <оттенок <0,58, насыщенность> 0,15 и значение <0,7 . تم تحديد كمية مناطق تعبير LacZ على الصور المركبة للقصبة الهوائية لكل حيوان باستخدام برنامج نصي MATLAB آلي (R2020a ، MathWorks) كما هو موضح سابقًا باستخدام إعدادات 0.35 <تدرج اللون <0.58 والتشبع> 0.15 والقيمة <0.7.من خلال تتبع ملامح الأنسجة في GIMP v2.10.24 ، تم إنشاء قناع يدويًا لكل صورة مركبة لتحديد منطقة الأنسجة ومنع أي اكتشافات خاطئة خارج أنسجة القصبة الهوائية.تم تلخيص المناطق الملطخة من جميع الصور المركبة من كل حيوان لإعطاء المساحة الكلية الملطخة لهذا الحيوان.ثم تم تقسيم المنطقة المطلية على المساحة الكلية للقناع للحصول على منطقة طبيعية.
تم تضمين كل القصبة الهوائية في البارافين ومقطعة بسمك 5 ميكرومتر.تمت مواجهة الأقسام باللون الأحمر السريع المحايد لمدة 5 دقائق وتم الحصول على الصور باستخدام مجهر Nikon Eclipse E400 وكاميرا DS-Fi3 وبرنامج التقاط عنصر NIS (الإصدار 5.20.00).
تم إجراء جميع التحليلات الإحصائية في GraphPad Prism v9 (GraphPad Software ، Inc.).تم تعيين الدلالة الإحصائية عند p 0.05.تم اختبار الحالة الطبيعية باستخدام اختبار Shapiro-Wilk وتم تقييم الاختلافات في تلطيخ LacZ باستخدام اختبار t غير المقترن.
تم فحص النواب الستة الموصوفين في الجدول 1 بواسطة PCXI ، ووُصفت الرؤية في الجدول 2. لم يكن اثنان من البوليسترين (MP1 و MP2 ؛ 18 ميكرومتر و 0.25 ميكرومتر ، على التوالي) مرئيين بواسطة PCXI ، ولكن يمكن تحديد العينات المتبقية (الأمثلة موضحة في الشكل 5).تكون ملفات MP3 و MP4 مرئية بشكل ضعيف (10-15٪ Fe3O4 ؛ 0.25 ميكرومتر و 0.9 ميكرومتر ، على التوالي).على الرغم من أن MP5 (98٪ Fe3O4 ؛ 0.25 ميكرومتر) تحتوي على بعض أصغر الجسيمات التي تم اختبارها ، إلا أنها كانت الأكثر وضوحًا.يصعب تمييز منتج CombiMag MP6.في جميع الحالات ، تم تحسين قدرتنا على اكتشاف MFs بشكل كبير عن طريق تحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا بالتوازي مع الشعيرات الدموية.مع تحرك المغناطيس بعيدًا عن الشعيرات الدموية ، تم سحب الجسيمات في سلاسل طويلة ، ولكن مع اقتراب المغناطيس وازدياد قوة المجال المغناطيسي ، تقصر سلاسل الجسيمات مع هجرة الجسيمات نحو السطح العلوي للشعيرات الدموية (انظر الفيديو التكميلي S1 : MP4) ، مما يزيد من كثافة الجسيمات على السطح.على العكس من ذلك ، عند إزالة المغناطيس من الشعيرات الدموية ، تنخفض شدة المجال ويعيد أعضاء البرلمان ترتيبهم في سلاسل طويلة تمتد من السطح العلوي للشعيرات الدموية (انظر الفيديو التكميلي S2: MP4).بعد أن يتوقف المغناطيس عن الحركة ، تستمر الجسيمات في الحركة لبعض الوقت بعد الوصول إلى وضع التوازن.عندما يتحرك MP باتجاه السطح العلوي للشعيرات الدموية وبعيدًا عنه ، تميل الجسيمات المغناطيسية إلى سحب الحطام عبر السائل.
تختلف رؤية MP تحت PCXI بشكل كبير بين العينات.(أ) MP3 ، (ب) MP4 ، (ج) MP5 و (د) MP6.تم التقاط جميع الصور المعروضة هنا بمغناطيس موضوع على بعد حوالي 10 مم فوق الشعيرات الدموية مباشرة.الدوائر الكبيرة الظاهرة هي فقاعات هواء محاصرة في الشعيرات الدموية ، تُظهر بوضوح ميزات الحواف السوداء والبيضاء لصورة تباين الطور.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.لاحظ أن أقطار دوائر المغناطيس في جميع الأشكال ليست قابلة للقياس وهي أكبر بحوالي 100 مرة مما هو موضح.
عندما يتحرك المغناطيس يسارًا ويمينًا على طول الجزء العلوي من الشعيرات الدموية ، تتغير زاوية سلسلة MP لتتماشى مع المغناطيس (انظر الشكل 6) ، وبالتالي تحديد خطوط المجال المغناطيسي.بالنسبة إلى MP3-5 ، بعد أن يصل الوتر إلى زاوية العتبة ، تسحب الجسيمات على طول السطح العلوي للشعيرات الدموية.يؤدي هذا غالبًا إلى تجمع أعضاء البرلمان في مجموعات أكبر بالقرب من حيث يكون المجال المغناطيسي أقوى (انظر الفيديو التكميلي S3: MP5).يتضح هذا أيضًا بشكل خاص عند التصوير بالقرب من نهاية الشعيرات الدموية ، مما يتسبب في تجمع MP وتركيزه في واجهة الهواء السائل.الجسيمات الموجودة في MP6 ، والتي كان تمييزها أصعب من تلك الموجودة في MP3-5 ، لا تسحب عندما يتحرك المغناطيس على طول الشعيرات الدموية ، لكن سلاسل MP انفصلت ، تاركة الجسيمات مرئية (انظر الفيديو التكميلي S4: MP6).في بعض الحالات ، عندما يتم تقليل المجال المغناطيسي المطبق عن طريق تحريك المغناطيس لمسافة طويلة من موقع التصوير ، ينزل أي أعضاء MP متبقين ببطء إلى السطح السفلي للأنبوب عن طريق الجاذبية ، ويظلون في السلسلة (انظر الفيديو التكميلي S5: MP3) .
تتغير زاوية الخيط MP عندما يتحرك المغناطيس إلى اليمين فوق الشعيرات الدموية.(أ) MP3 ، (ب) MP4 ، (ج) MP5 و (د) MP6.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.يرجى ملاحظة أن مقاطع الفيديو الإضافية هي لأغراض إعلامية لأنها تكشف عن بنية جزيئية مهمة ومعلومات ديناميكية لا يمكن تصورها في هذه الصور الثابتة.
أظهرت اختباراتنا أن تحريك المغناطيس ذهابًا وإيابًا ببطء على طول القصبة الهوائية يسهل تصور MF في سياق الحركة المعقدة في الجسم الحي.لم يتم إجراء أي اختبارات في الجسم الحي لأن حبيبات البوليسترين (MP1 و MP2) لم تكن مرئية في الشعيرات الدموية.تم اختبار كل من الأربعة MFs المتبقية في الجسم الحي مع المحور الطويل للمغناطيس الموضوع فوق القصبة الهوائية بزاوية حوالي 30 درجة إلى العمودي (انظر الشكلين 2 ب و 3 أ) ، حيث أدى ذلك إلى سلاسل MF أطول وكان أكثر فعالية من المغناطيس..تم إنهاء التكوين.لم يتم العثور على ملفات MP3 و MP4 و MP6 في القصبة الهوائية لأي حيوان حي.عند تصور الجهاز التنفسي للفئران بعد قتل الحيوانات بطريقة إنسانية ، ظلت الجسيمات غير مرئية حتى عند إضافة حجم إضافي باستخدام مضخة حقنة.يحتوي MP5 على أعلى محتوى من أكسيد الحديد وكان الجسيم المرئي الوحيد ، لذلك تم استخدامه لتقييم وتوصيف سلوك MP5 في الجسم الحي.
أدى وضع المغناطيس فوق القصبة الهوائية أثناء إدخال MF إلى تركيز العديد من MFs ، ولكن ليس كلها ، في مجال الرؤية.من الأفضل ملاحظة دخول الجسيمات إلى القصبة الهوائية في الحيوانات التي تم قتلها بطريقة بشرية.يوضح الشكل 7 والفيديو التكميلي S6: MP5 التقاط مغناطيسي سريع ومحاذاة للجسيمات على سطح القصبة الهوائية البطنية ، مما يشير إلى أنه يمكن استهداف أعضاء البرلمان في المناطق المرغوبة من القصبة الهوائية.عند البحث بعيدًا على طول القصبة الهوائية بعد توصيل MF ، تم العثور على بعض MFs بالقرب من carina ، مما يشير إلى شدة مجال مغناطيسي غير كافية لجمع كل MFs والاحتفاظ بها ، حيث تم تسليمها عبر منطقة أقصى شدة مجال مغناطيسي أثناء إدارة السوائل.معالجة.ومع ذلك ، كانت تركيزات MP بعد الولادة أعلى حول منطقة الصورة ، مما يشير إلى أن العديد من أعضاء البرلمان ظلوا في مناطق مجرى الهواء حيث كانت شدة المجال المغناطيسي المطبقة أعلى.
صور (أ) قبل و (ب) بعد تسليم MP5 في القصبة الهوائية لفأر تم التخلص منه مؤخرًا بمغناطيس يوضع فوق منطقة التصوير مباشرة.تقع المنطقة المصورة بين حلقتين غضروفيتين.هناك بعض السوائل في الشعب الهوائية قبل أن يتم تسليم النائب.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.هذه الصور مأخوذة من الفيديو المعروض في S6: MP5 الفيديو التكميلي.
أدى تحريك المغناطيس على طول القصبة الهوائية في الجسم الحي إلى حدوث تغيير في زاوية السلسلة MP على سطح مجرى الهواء ، على غرار تلك التي لوحظت في الشعيرات الدموية (انظر الشكل 8 والفيديو التكميلي S7: MP5).ومع ذلك ، في دراستنا ، لا يمكن جر النواب على طول سطح المسالك التنفسية الحية ، كما تفعل الشعيرات الدموية.في بعض الحالات ، تطول سلسلة MP بينما يتحرك المغناطيس يسارًا ويمينًا.ومن المثير للاهتمام ، وجدنا أيضًا أن سلسلة الجسيمات تغير عمق الطبقة السطحية للسائل عندما يتحرك المغناطيس طوليًا على طول القصبة الهوائية ، ويتمدد عندما يتحرك المغناطيس مباشرة فوق الرأس وتدور سلسلة الجسيمات إلى الوضع الرأسي (انظر فيديو تكميلي S7).: MP5 عند 0:09 ، أسفل اليمين).تغير نمط الحركة المميز عندما تم تحريك المغناطيس بشكل جانبي عبر الجزء العلوي من القصبة الهوائية (أي إلى يسار أو يمين الحيوان ، بدلاً من طول القصبة الهوائية).كانت الجسيمات لا تزال مرئية بوضوح أثناء حركتها ، ولكن عندما تمت إزالة المغناطيس من القصبة الهوائية ، أصبحت أطراف أوتار الجسيمات مرئية (انظر الفيديو التكميلي S8: MP5 ، بدءًا من 0:08).هذا يتفق مع السلوك الملحوظ للمجال المغناطيسي تحت تأثير مجال مغناطيسي مطبق في شعري زجاجي.
عينة من الصور تظهر MP5 في القصبة الهوائية لجرذ حي مخدر.(أ) يستخدم المغناطيس للحصول على صور أعلى وإلى يسار القصبة الهوائية ، ثم (ب) بعد تحريك المغناطيس إلى اليمين.يشير المربع الأحمر إلى التكبير الذي يعزز التباين.هذه الصور مأخوذة من الفيديو المعروض في الفيديو التكميلي S7: MP5.
عندما تم ضبط القطبين في اتجاه الشمال والجنوب أعلى وأسفل القصبة الهوائية (أي جذب ؛ الشكل 3 ب) ، ظهرت الحبال MP أطول وكانت تقع على الجدار الجانبي للقصبة الهوائية بدلاً من السطح الظهري للقصبة الهوائية القصبة الهوائية (انظر الملحق).فيديو S9: MP5).ومع ذلك ، لم يتم اكتشاف تركيزات عالية من الجسيمات في موقع واحد (أي السطح الظهري للقصبة الهوائية) بعد إعطاء السوائل باستخدام جهاز مغناطيسي مزدوج ، والذي يحدث عادةً باستخدام جهاز مغناطيسي واحد.بعد ذلك ، عندما تم تكوين مغناطيس واحد لصد الأقطاب المتقابلة (الشكل 3 ج) ، لم يزداد عدد الجسيمات المرئية في مجال الرؤية بعد التسليم.يعد إعداد كلا شكلي المغناطيس أمرًا صعبًا نظرًا لشدة المجال المغناطيسي العالية التي تجذب أو تدفع المغناطيسات على التوالي.تم تغيير الإعداد بعد ذلك إلى مغناطيس واحد موازٍ للممرات الهوائية ولكنه يمر عبر الممرات الهوائية بزاوية 90 درجة بحيث تعبر خطوط القوة جدار القصبة الهوائية بشكل متعامد (الشكل ثلاثي الأبعاد) ، وهو اتجاه يهدف إلى تحديد إمكانية تجميع الجسيمات على الجدار الجانبي.أن يلاحظ.ومع ذلك ، في هذا التكوين ، لم تكن هناك حركة تراكم MF يمكن تحديدها أو حركة مغناطيسية.بناءً على كل هذه النتائج ، تم اختيار تكوين بمغناطيس واحد واتجاه 30 درجة للدراسات في الجسم الحي لحاملات الجينات (الشكل 3 أ).
عندما تم تصوير الحيوان عدة مرات على الفور بعد التضحية به بشكل إنساني ، فإن عدم وجود حركة الأنسجة المتداخلة يعني أنه يمكن تمييز خطوط الجسيمات الدقيقة والأقصر في المجال الواضح بين الغضروف ، `` يتأرجح '' وفقًا للحركة الانتقالية للمغناطيس.ترى بوضوح وجود وحركة جسيمات MP6.
كان عيار LV-LacZ 1.8 × 108 وحدة دولية / مل ، وبعد الخلط 1: 1 مع CombiMag MP (MP6) ، تم حقن الحيوانات بـ 50 ميكرولتر من جرعة القصبة الهوائية من 9 × 107 وحدة دولية / مل من مركبة منخفضة الجهد (أي 4.5 × 106 TU / فأر).).).في هذه الدراسات ، بدلًا من تحريك المغناطيس أثناء المخاض ، قمنا بتثبيت المغناطيس في موضع واحد لتحديد ما إذا كان يمكن تحسين نقل الجهد المنخفض (أ) مقارنةً بالتوصيل المتجه في حالة عدم وجود مجال مغناطيسي ، و (ب) إذا كان مجرى الهواء قادرًا على ذلك كن مركزا.يتم نقل الخلايا في المناطق المستهدفة المغناطيسية في الجهاز التنفسي العلوي.
لا يبدو أن وجود المغناطيس واستخدام CombiMag بالاقتران مع ناقلات LV يؤثر سلبًا على صحة الحيوان ، كما فعل بروتوكول توصيل ناقل LV القياسي.أظهرت الصور الأمامية لمنطقة القصبة الهوائية التي تعرضت للاضطراب الميكانيكي (الشكل التكميلي 1) أن المجموعة المعالجة LV-MP لديها مستويات أعلى بكثير من التنبيغ في وجود مغناطيس (الشكل 9 أ).لم يكن هناك سوى كمية صغيرة من تلطيخ LacZ الأزرق في المجموعة الضابطة (الشكل 9 ب).أظهر القياس الكمي للمناطق الطبيعية الملطخة بـ X-Gal أن إعطاء LV-MP في وجود مجال مغناطيسي أدى إلى تحسن بنحو 6 أضعاف (الشكل 9 ج).
مثال على الصور المركبة التي تظهر تحويل القصبة الهوائية باستخدام LV-MP (أ) في وجود مجال مغناطيسي و (ب) في حالة عدم وجود مغناطيس.(ج) تحسن ذو دلالة إحصائية في المنطقة الطبيعية لتوصيل LacZ في القصبة الهوائية باستخدام مغناطيس (* p = 0.029 ، اختبار t ، n = 3 لكل مجموعة ، يعني ± الخطأ المعياري للمتوسط).
أشارت المقاطع المحايدة الملطخة باللون الأحمر (المثال الموضح في الشكل التكميلي 2) إلى أن الخلايا الملطخة بـ LacZ كانت موجودة في نفس العينة وفي نفس الموقع كما تم الإبلاغ عنه سابقًا.
يظل التحدي الرئيسي في العلاج الجيني لمجرى الهواء هو التحديد الدقيق للجزيئات الحاملة في المجالات ذات الاهتمام وتحقيق مستوى عالٍ من كفاءة النقل في الرئة المتنقلة في وجود تدفق الهواء وإزالة المخاط النشط.بالنسبة إلى ناقلات الجهد المنخفض المصممة لعلاج أمراض الجهاز التنفسي في التليف الكيسي ، فإن زيادة وقت بقاء الجسيمات الحاملة في الممرات الهوائية الموصلة كان هدفًا بعيد المنال حتى الآن.كما أشار كاستيلاني وزملاؤه ، فإن استخدام المجالات المغناطيسية لتعزيز النقل له مزايا مقارنة بطرق توصيل الجينات الأخرى مثل التثقيب الكهربائي لأنه يمكن أن يجمع بين البساطة والاقتصاد والتسليم المحلي والكفاءة المتزايدة ووقت الحضانة الأقصر.وربما جرعة أقل من السيارة 10.ومع ذلك ، لم يتم وصف الترسب في الجسم الحي وسلوك الجسيمات المغناطيسية في الممرات الهوائية تحت تأثير القوى المغناطيسية الخارجية ، وفي الواقع لم يتم إثبات قدرة هذه الطريقة على زيادة مستويات التعبير الجيني في الممرات الهوائية الحية السليمة في الجسم الحي.
أظهرت تجاربنا في المختبر على السنكروترون PCXI أن جميع الجسيمات التي اختبرناها ، باستثناء البوليسترين MP ، كانت مرئية في إعداد التصوير الذي استخدمناه.في وجود مجال مغناطيسي ، تشكل الحقول المغناطيسية خيوطًا يرتبط طولها بنوع الجسيمات وقوة المجال المغناطيسي (أي قرب المغناطيس وحركته).كما هو مبين في الشكل 10 ، تتشكل الأوتار التي نلاحظها عندما يصبح كل جسيم منفرد ممغنطًا ويحفز مجاله المغناطيسي المحلي.تتسبب هذه الحقول المنفصلة في تجميع جسيمات أخرى مماثلة والتواصل مع حركات سلسلة المجموعة بسبب القوى المحلية من قوى الجذب والتنافر المحلية للجسيمات الأخرى.
رسم تخطيطي يوضح (أ ، ب) سلاسل من الجسيمات تتشكل داخل الشعيرات الدموية المملوءة بالسوائل و (ج ، د) القصبة الهوائية المليئة بالهواء.لاحظ أن الشعيرات الدموية والقصبة الهوائية لا يتم رسمها على نطاق واسع.تحتوي اللوحة (أ) أيضًا على وصف MF المحتوي على جسيمات Fe3O4 المرتبة في سلاسل.
عندما تحرك المغناطيس فوق الشعيرات الدموية ، وصلت زاوية سلسلة الجسيمات إلى العتبة الحرجة لـ MP3-5 التي تحتوي على Fe3O4 ، وبعد ذلك لم تعد سلسلة الجسيمات في موضعها الأصلي ، ولكنها انتقلت على طول السطح إلى موضع جديد.مغناطيس.من المحتمل أن يحدث هذا التأثير لأن سطح الأنبوب الشعري الزجاجي أملس بدرجة كافية للسماح بحدوث هذه الحركة.ومن المثير للاهتمام أن MP6 (CombiMag) لم تتصرف بهذه الطريقة ، ربما لأن الجسيمات كانت أصغر ، أو لها طلاء مختلف أو شحنة سطحية مختلفة ، أو أن السائل الحامل قد أثر على قدرتها على الحركة.كما أن التباين في صورة جسيمات CombiMag أضعف أيضًا ، مما يشير إلى أن السائل والجسيمات قد يكون لها نفس الكثافة وبالتالي لا يمكنها التحرك بسهولة تجاه بعضهما البعض.يمكن أن تتعطل الجزيئات أيضًا إذا تحرك المغناطيس بسرعة كبيرة ، مما يشير إلى أن شدة المجال المغناطيسي لا يمكنها دائمًا التغلب على الاحتكاك بين الجسيمات في السائل ، مما يشير إلى أن شدة المجال المغناطيسي والمسافة بين المغناطيس والمنطقة المستهدفة يجب ألا تأتي على شكل مفاجئة.مهم.تشير هذه النتائج أيضًا إلى أنه على الرغم من أن المغناطيس يمكنه التقاط العديد من الجسيمات الدقيقة التي تتدفق عبر المنطقة المستهدفة ، فمن غير المرجح أن يمكن الاعتماد على المغناطيسات لتحريك جزيئات CombiMag على طول سطح القصبة الهوائية.وهكذا ، خلصنا إلى أن دراسات LV MF في الجسم الحي يجب أن تستخدم مجالات مغناطيسية ثابتة لاستهداف مناطق معينة من شجرة مجرى الهواء فعليًا.
بمجرد وصول الجسيمات إلى الجسم ، يصعب تحديدها في سياق النسيج المتحرك المعقد للجسم ، ولكن تم تحسين قدرتها على الكشف عن طريق تحريك المغناطيس أفقيًا فوق القصبة الهوائية من أجل "اهتزاز" سلاسل MP.في حين أن التصوير في الوقت الحقيقي ممكن ، فمن الأسهل تمييز حركة الجسيمات بعد أن يُقتل الحيوان بطريقة بشرية.كانت تركيزات MP عادةً أعلى في هذا الموقع عندما تم وضع المغناطيس فوق منطقة التصوير ، على الرغم من أن بعض الجسيمات توجد عادةً أسفل القصبة الهوائية.على عكس الدراسات المختبرية ، لا يمكن سحب الجسيمات إلى أسفل القصبة الهوائية بواسطة حركة المغناطيس.تتوافق هذه النتيجة مع الطريقة التي يعالج بها المخاط الذي يغطي سطح القصبة الهوائية الجزيئات المستنشقة ، ويحبسها في المخاط ثم يزيلها من خلال آلية إزالة الغشاء المخاطي الهدبي.
افترضنا أن استخدام المغناطيس أعلى وأسفل القصبة الهوائية للجذب (الشكل 3 ب) يمكن أن يؤدي إلى مجال مغناطيسي أكثر اتساقًا ، بدلاً من مجال مغناطيسي شديد التركيز عند نقطة واحدة ، مما قد يؤدي إلى توزيع أكثر اتساقًا للجسيمات..ومع ذلك ، لم تجد دراستنا الأولية دليلًا واضحًا لدعم هذه الفرضية.وبالمثل ، فإن ضبط زوج من المغناطيس على النبض (الشكل 3 ج) لم ينتج عنه استقرار أكثر للجسيمات في منطقة الصورة.توضح هاتان النتيجتان أن إعداد المغناطيس المزدوج لا يحسن بشكل كبير التحكم المحلي لتوجيه MP ، وأن القوى المغناطيسية القوية الناتجة يصعب ضبطها ، مما يجعل هذا النهج أقل عملية.وبالمثل ، فإن توجيه المغناطيس أعلى وعبر القصبة الهوائية (الشكل ثلاثي الأبعاد) لم يؤدي أيضًا إلى زيادة عدد الجسيمات المتبقية في منطقة التصوير.قد لا تنجح بعض هذه التكوينات البديلة لأنها تؤدي إلى انخفاض في شدة المجال المغناطيسي في منطقة الترسيب.وبالتالي ، فإن تكوين المغناطيس الفردي عند 30 درجة (الشكل 3 أ) يعتبر أبسط طرق الاختبار وأكثرها كفاءة في الجسم الحي.
أظهرت دراسة LV-MP أنه عندما تم دمج نواقل LV مع CombiMag وتسليمها بعد تعرضها للاضطراب الجسدي في وجود مجال مغناطيسي ، زادت مستويات النقل بشكل ملحوظ في القصبة الهوائية مقارنةً بالضوابط.بناءً على دراسات التصوير السنكروتروني ونتائج LacZ ، يبدو أن المجال المغناطيسي قادر على إبقاء LV في القصبة الهوائية وتقليل عدد الجسيمات المتجهة التي توغلت على الفور في عمق الرئة.يمكن أن تؤدي تحسينات الاستهداف هذه إلى كفاءة أعلى مع تقليل التتر المتوفر ، والتنقل غير المستهدف ، والآثار الجانبية الالتهابية والمناعة ، وتكاليف نقل الجينات.الأهم من ذلك ، وفقًا للشركة المصنعة ، يمكن استخدام CombiMag مع طرق نقل الجينات الأخرى ، بما في ذلك النواقل الفيروسية الأخرى (مثل AAV) والأحماض النووية.